垂序商陆繁殖期各器官锰富集规律及其对种子萌发的影响

廖 阳，闫荣玲，何永峰，龚令军，殷小林

（湖南科技学院 化学与生物工程学院，湖南永州425199）

锰是植物所需微量元素的重要一员，它对细胞器正常结构的维持，光合作用的氧化还原反应以及体内酶的激活等均具有重要意义［1］。但过量锰则形成一种不利于植物生长的胁迫逆境［2－6］。在一定胁迫程度和持续时间内，植物可以通过多种机制抵御锰富集带来的不利影响，并尽可能完成自身生命周期，但当胁迫超过植物应对能力后，则会在分子、细胞、器官、植株等多个水平表现出严重异常甚至死亡［7－9］。根系吸收的锰离子会向上运输至茎、叶等器官，进入繁殖期后则继续向生殖器官转移、分配，进而可能影响植株的繁殖能力。

垂序商陆（Phytolaccaamericana）是具锰超富集能力的多年生草本植物，其叶片中锰含量可超过25g·kg－1，远高于其他植物［10－11］。另外，垂序商陆还具有适应性好、繁殖力强、生长速度快、地理分布广、生物量大等众多优点，因此是开展锰污染土壤生物修复治理的理想植物种类［12］。迄今，已经对高锰胁迫下垂序商陆体内锰离子的富集规律，以及锰富集对植株组织结构、生理特征的影响等方面作了初步 研究［9，11，13］。但这些研究所进行的锰胁迫处理时间较短，且均在垂序商陆的非繁殖期进行，目前还未见有关锰胁迫下垂序商陆生殖器官锰富集规律的报道，且锰在生殖器官内的富集对植株的繁殖能力会产生怎样的影响也还不明了。本研究试图对上述问题进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 植株培养与处理

2013年5月，将采自湖南科技学院校园附近空地的72株长势一致的野生垂序商陆幼苗栽于装有河沙的塑料桶内，所取河沙预先进行了清洗和过筛。各组幼苗置于可避雨的临时棚内生长，棚四周与外界相通。幼苗分成3组，每组24株，每组设3次重复。其中一组为对照组，所浇霍兰氏培养液不再额外添加锰离子（浓度为0.005 mmol／L），另两组为处理组，依据有关文献［9，11］培养液中锰离子的浓度分别设置为0.1和1.0mmol／L（属于轻度至中度胁迫水平），额外锰离子添加试剂为MnCl2·4H2O。营养液每5d浇洒1次，每桶均为0.5L，中间根据实际情况适当补水。植株培养至2013年9月上旬实验结束，此时收获各组植株所结种子。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 器官锰含量 2013年6月至8月标记一批同步开花的花朵，跟踪观察其从闭合花蕾到结果以及果实（种子）整个成熟过程，并根据果实的表观性状（大小、颜色、果浆量等）在不同阶段（6月25日、7月15日、7月28日、8月8日、8月18日、8月30日）进行6次植株不同器官锰含量的测定。测定时，先用自来水冲洗干净拔出的植株，再用去离子水洗2次，之后分离根、茎、叶、果实置于经硝酸浸泡处理过的干净研钵内，于70℃烘箱内烘干至恒重后研磨至粉末状，其中果实在研磨前分出一部分，分离出种子并在显微镜下确定种子表面无其他附着物，再次清洗并烘干后置于另一研钵内研磨。研磨得到的植株不同部位粉末称取0.1～0.2g经硝酸与高氯酸4：1混合液充分消化后，用原子吸收分光光度法（WFX－1E2型原子吸收仪，北京）测定各器官锰含量。测定时仪器参数：波长279.5nm；灯电流3.0 mA；狭缝0.2nm；空气流量6.5L／min；乙炔流量1.7L／min。

同时，在测定种子中锰含量基础上，计算各次取样种子中锰含量较前一次的变化率，计算公式为：变化率（%）＝（第N 次锰含量测量值－第N－1次测量值）×100／第N－1次测量值。

1.2.2 果汁中有机酸成分及含量 在最后一次采样时，各处理组均选取颗粒饱满的部分果实，撕开果皮后，轻轻挤压收集果汁后离心（2 000r／min）取上清液。准确吸取样品120mL，浓缩至30mL 左右后，置于150mL 碘量瓶中，加入60mL 12.5%硫酸甲醇溶液（冷水浴冷却和搅拌条件下，将20 mL 浓H2SO4缓慢加入160 mL 无水甲醇中摇匀制得）。混匀后30 ℃（转速150r／min）恒温振荡酯化24h。将甲酯化后的样液置于150 mL 的分液漏斗中，用二氯甲烷萃取3 次（20mL×3），合并萃取液。用饱和氯化钠溶液洗涤2 次（20mL×2），再用无水硫酸钠（10g）脱水，静置过夜后滤出硫酸钠，滤液浓缩至30 mL，参照已有文献使用气质联用仪（岛津QP2010S）进行GC－MS分析［14］。

1.2.3 种子萌发率 收集不同锰离子浓度下各组植株颗粒饱满的种子，于2014年4月进行种子萌发实验。在硬质玻璃培养皿中叠放两张圆形滤纸，用去离子水充分润湿滤纸。种子经2.5%次氯酸钠溶液浸种20min后用去离子水冲洗3次再置于滤纸上，每皿30 粒，每组设置3 次重复，盖好皿盖置于25 ℃恒温培养箱中等待萌发，跟踪观察并注意补水保持滤纸湿润，于第10天统计种子的萌发率。萌发率的计算公式为：

萌发率＝（发芽种子总数／供试种子总数）×100%。

1.3 数据分析

用Excel 2003、SPSS19.0 以 及Sigmaplot10.0等软件对数据进行整理、分析与作图。

2 结果与分析

2.1 种子成熟过程中果实与种子的表观变化特征

各组垂序商陆植株5月中旬后不断挂果，果内所含种子（近似肾形）随时间推移不断成熟。在此过程中，果实的大小、重量、果汁量、颜色以及种子的大小颜色、硬度等性状均不断变化。其中，花（果）枝远端的果实生长速度较近端果实慢，果实颜色由最初的绿色逐渐变为棕色再变成最终的黑色。果枝与果柄的颜色也逐渐由绿色变为浅红直至最终深紫色。果实中的果浆含量随果实表观变化表现为先增加后减少最后完全消失，仅剩透明薄皮包裹种子（果浆减少过程中，果皮形成越来越明显的褶皱）。在此过程中，果实内的种子从乳白半透明逐渐变为黑色，体积逐渐增大至芝麻粒大小且硬度不断增加。图1示对照组种子成熟过程的不同时间节点果实与种子的表观状态，各图分别对应实验的第1次（阶段）至第6次（阶段）取材，各次对应的日期分别为6月25日、7月15日、7月28日、8月8日、8月18日和8月30日。跟踪观察过程中未发现锰处理组与对照组的果实和种子在表观形态上表现出差异。

2.2 垂序商陆种子成熟过程中植株各器官锰含量动态变化

对种子成熟过程中垂序商陆不同器官锰含量进行分析发现，随时间推移对照组和处理组植株的根、茎、叶、果实（含种子）的锰含量均呈持续增加趋势。种子内锰含量的变化在对照与处理组之间存在差异：种子内锰含量在对照组（0.005mmol／L）中于初期先出现少许下降（4.0%），之后持续增加，且在最后阶段微弱增加（1.2%；图2，A）；而处理组（0.1 mmol／L与1.0mmol／L）则整体变化趋势相似，均先持续增加，并于8月8日达到最大值，到种子成熟末期再有所减少，且1.0mmol／L 组的变化幅度在各阶段均大于0.1mmol／L组（图2，B、C）。

图1 对照组种子成熟过程中垂序商陆果实与种子的表观变化Fig.1 Apparent change of fruits and seeds during seed maturation process of Phytolacca americana of control group

同时，处理间相比较，各器官锰含量随培养环境锰离子浓度的升高而大幅明显增加，同一器官不同浓度下锰含量始终表现为1.0 mmol／L 组＞0.1 mmol／L组＞0.005mmol／L 组（图2）。另外，器官间相比较而言，种子成熟后期，各组不同器官锰含量高低顺序均为种子＜茎＜根＜果实＜叶，果实的锰含量远高于种子中的锰含量（图2），即果浆或果皮中分配和富集了大量的锰。

另外，GC－MS分析表明，果浆中的有机酸主要为草酸（占有机酸总量的95.5%）以及少量的2－羟基丙酸（占有机酸总量的4.5%；图3、表1）；各处理组果汁有机酸成分相同，含量无明显变化（P＞0.05，表1）。

图2 不同锰浓度下垂序商陆各器官锰含量动态变化Fig.2 Dynamic changes of the manganese content in different organs of P.americana

图3 垂序商陆果汁中2－羟基丙酸（A）和草酸（B）GC－MS分析质谱图（1.0mmol／L组）Fig.3 Mass spectrometry of 2－hydroxy propionic acid（A）and oxalic acid（B）in P.americanajuice（1.0mmol／L group）

图4 不同锰浓度下垂序商陆种子在成熟过程中锰含量变化规律及其萌发率Fig.4 Comparison of manganese content change in seeds during the maturation process and seed germination rate of P.americanaamong different manganese concentrations

表1 不同浓度组果汁有机酸含量比较Table1 Comparison of the content of organic acid in fruit juice among different group with different manganese concentrations

2.3 锰胁迫对垂序商陆种子锰含量和萌发率的影响

图4显示，垂序商陆种子内锰含量变化趋势及变化程度在不同浓度间明显不同。CK 组种子锰含量在初期出现少许下降（4.0%），且在最后阶段微弱增加（1.2%）；2个不同浓度的锰胁迫处理组整体变化趋势相似，且在后期均出现不同程度负增长；同时，所有各阶段锰含量的变化率始终表现为1.0 mmol／L均大于0.1mmol／L。另外，0.005、0.1和1.0mmol／L 3个不同锰浓度下植株所结种子萌发率分别为97.8%、88.9%、78.8%，三者间差异极显著（P＜0.01），即垂序商陆所处培养液锰浓度越高，种子萌发率则越低。

3 讨 论

植物遭受锰胁迫后会发生积极灵敏的生理响应，并通过区域化隔离、根系有机酸螯合、限制吸收与外排、抗氧化系统增强、离子间交互等多种机制来抵御锰胁迫［1，15］。不同植物对锰的耐受能力差异明显，木本植物中的马尾松（Pinusmassoniana）与山茶科植物，以及生长在被锰矿尾渣污染的土壤中的早熟禾（Poaannua）、鼠麴草（Gnaphaliumaffine）等物种耐性较强［4，16－17］。尽管如此，这些植物对锰的耐受与富集能力相比垂序商陆还是低得多。研究表明，垂序商陆植株体内锰富集量远超人们对锰超累积植物的界定标准（10 000 mg／kg）［11，17］。本研究中未发现锰胁迫处理组垂序商陆植株果实出现表观异常，即所设锰处理浓度均在其耐受范围内，这与已有报道相符［12－13］。同时，可能由于所设锰浓度较低，未形成导致出现严重生理机能障碍的严重胁迫，因此对照组与处理组植株的果汁中有机酸成分及含量没有表现出显著差异。

有研究表明，垂序商陆吸收的锰有87%～95%被转移到地上部分［18］。当植株进入繁殖期形成花、果实、种子等生殖器官后，锰离子会继续向这些新形成的器官转运。本研究发现，垂序商陆生殖生长过程中各器官内锰含量随锰离子处理浓度的升高而增加，锰胁迫处理组植株各器官锰含量远高于对照组，且相同浓度下不同器官内锰含量表现为种子＜茎＜根＜果实＜叶。可见，不同锰离子浓度（低浓度，≤1 mmol／L）下，根、茎、叶3个营养器官在繁殖期对锰的累积规律及各器官锰含量高低关系与非繁殖期类似，且叶片是锰在垂序商陆体内累积的主要器官［12－13，19－20］。值得注意的是，果实锰含量远高于其内部所包裹的种子的锰含量，推测垂序商陆的果汁内富集了较高水平的锰，这可能与果浆高水溶性环境密切相关。已有研究证实，垂序商陆叶细胞的液泡等高可溶性环境储存了叶片中锰含量的绝大部分（74%～80%），从而缓解锰过量对叶细胞的伤害，也减轻了植株其他器官锰富集的压力［21］。那么，其果汁的高水溶性环境是否也是一个重要的缓解锰胁迫的场所，其作用机制如何，这些还需要进一步的研究来证实。

GC－MS分析显示，垂序商陆果汁中存在丰富的有机酸，主要成分为草酸以及少量的2－羟基丙酸。有研究证明有机酸在植物根、叶的解锰毒中发挥了重要作用，特别是草酸因其与金属离子有很强的亲和力，因此是植物体内与锰解毒机制密切相关的4种有机酸之一（另外3 种为柠檬酸、苹果酸和琥珀酸）［22］。因此，推测有机酸是垂序商陆果浆中可富集高水平锰的重要原因。鉴于果汁几乎不参与植株的重要生理活动，把大量锰转移到果汁中对植株本身来说是有利的。另外，由于植株上成熟的果实最终会脱离母体，因此分批成熟的果实中，较早期成熟的果实在脱离母体的同时也带走了其所含的锰，这与叶片会优先把锰累积在不太重要的表皮细胞，以及通过表皮毛把锰排出体外（外排效应）效果类似［23］。可见，垂序商陆在果汁中富集锰是一个十分巧妙的策略。结果同时提示，利用垂序商陆进行土壤修复时，应及时采摘已成熟果实，防止其掉落地面使锰回归土壤。

植物遭受严重锰胁迫后，往往生物量减少、衰老提前、生理异常甚至死亡［24－25］。由于本实验所设置的处理组锰离子浓度较低，在垂序商陆的耐受能力范围内，因此各组植株均正常生长、开花、挂果、结籽从而完成当年的生长周期。本实验结果显示，垂序商陆种子的锰含量随处理浓度的增加而升高，萌发率则随之降低，提示垂序商陆种子内的锰富集会降低商陆的繁殖能力，且胁迫程度越高影响越显著。体外重金属浸种实验也发现，当浸种液中锰离子浓度超过一定值后，种子萌发率急剧下降［26－27］。值得注意的是，处理组种子中锰含量在成熟后期不增反减，且锰浓度越高减少越明显，这可能是垂序商陆的一种自我保护策略，即在成熟末期迁移出部分锰以降低种子中锰含量来提高种子萌发率，从而维持自身较高繁殖能力。

综上所述，垂序商陆作为一种锰超富集植物，对环境中的锰离子浓度响应灵敏，且植株各器官内锰积累量与环境中锰浓度密切相关；处于繁殖期的垂序商陆在锰胁迫环境中会把累积到体内的过量锰尽可能合理地分配到不同器官中，以降低锰富集所带来的毒害效应从而完成生命周期；在种子成熟末期，其还可能采取降低种子中锰分配量的策略来提高萌发率从而保证高繁殖能力，果浆的可溶性水环境及其所含的有机酸在繁殖期植株解锰毒中发挥了重要作用。该研究结果为了解高锰条件下繁殖期垂序商陆对锰离子的转移与分配规律以及垂序商陆在生态修复中的实际应用提供些许参考。

［1］ REN L M（任立民），LIU P（刘 鹏）.Review of manganese toxicity ＆the mechanisms of plant tolerance［J］.ActaEcologicaSinica（生态学报），2007，27（1）：357－367（in Chinese）.

［2］ REICHMAN S M，MENZIES N W，ASHER C J，etal.Seedling responses of four Australian tree species to toxic concentrations of manganese in solution culture［J］.PlantandSoil，2004，258（1）：341－350.

［3］ ZENG Q（曾 琦），GENG M J（耿明建），ZHANG ZH J（张志江），etal.Effect of Mn toxicity on the content of Mn，Ca，Fe and the activity of POD and CAT inBrassicanapusL.，at seedling stage［J］.J.HuazhongAgric.Univ.（华中农业大学学报），2004，23（3）：300－303（in Chinese）.

［4］ CHANG SH Q（常硕其），PENG K Q（彭克勤），ZHANG Y L（张亚莲），etal.Effect of Mn addition treatment on accumulation of Mn and physiological active substance in tea plants［J］.J.TeaSci.（茶叶科学），2008，28（5）：331－338（in Chinese）.

［5］ ZHANG Y X（张玉秀），HUANG ZH B（黄智博），ZHANG H M（张红梅），etal.Antioxidative response ofPhytolaccaamericanaandNicotianatabacumto manganese stresses［J］.Environ.Sci.（环境科学），2009，30（12）：3 676－3 683（in Chinese）.

［6］ GONG J F（宫杰芳），ZHOU Y CH（周运超），LI X Y（李小永），etal.Responses of physiological indices ofPinusmassonianaseedlings to high manganese stress［J］.Chin.J.Ecol.（生态学杂志），2012，31（3）：520－525（in Chinese）.

［7］ DELHAIZE E，GRUBER B D，PITTMAN J K，etal.A role for theAtMTP11gene of Arabidopsis in manganese transport and tolerance［J］.PlantJ，2007，51（2）：198－210.

［8］ CHEN Y ZH（陈燕珍），TAO Y M（陶毅明），LIANG ZH X（梁振鑫），etal.Effects of protective enzymes ofPhytolaccaacinosunder Mnanganese stress［J］.J.Biol.（生物学杂志），2008，25（3）：44－47（in Chinese）.

［9］ LIANG W B（梁文斌），XUE SH G（薛生国），SHEN J H（沈吉红），etal.Manganese stress on morphological structures of leaf and ultrastructures of chloroplast of a manganese hyperaccumulator，Phytolaccaamericana［J］.ActaEcologicaSinica（生态学报），2011，31（13）：3 677－3 683（in Chinese）.

［10］ XUE SH G（薛生国），CHEN Y X（陈英旭），LIN Q（林 琦），etal.PhytolaccaacinosaRoxb.（Phytolaccaceae）：A new manganese hyperaccumulator plant from Southern China［J］.ActaEcologicaSinica（生态学报），2003，23（5）：935－937（in Chinese）.

［11］ ZHAO Y L（赵盈丽），YOU SH H（游少鸿），LIU J（刘 杰），etal.Experimental research of phytoremediation properties aboutPhytolaccaacinosaRoxb on Mn－contaminated soil［J］.Guihaia（广西植物），2014，34（3）：344－347（in Chinese）.

［12］ XUE SH G（薛生国），YE SH（叶 晟），ZHOU F（周 菲），etal.Identity ofPhytolaccaamericanaL.（Phytolaccaceae），Pokeweed：a manganese hyperaccumulator plant［J］.ActaEcologicaSinica（生态学报），2008，28（12）：6 344－6 347（in Chinese）.

［13］ XUE SH G（薛生国），LIU F H（刘丰豪），WU CH（吴 川），etal.Kinetics of manganese uptake and accumulation in hyperaccumulator plantPhytolaccaamericanaLinn.［J］.J.CentralSouthUni.（Science and Technology）（中南大学学报·自然科学版），2012，43（2）：424－428（in Chinese）.

［14］ LIU F ZH（刘凤珠），NIU X M（牛小明），WANG Y Y（王颖颖）.Analysis of organic acidin fruit vineger［J］.Chin.Condiment（中国调味品），2010，35（11）：107－115（in Chinese）.

［15］ ZHANG Y X（张玉秀），LI L F（李林峰），CHAI T Y（柴团耀），etal.Mechanisms of manganese toxicity and manganese tolerance in plants［J］.Chin.Bull.ofBot.（植物学报），2010，45（4）：506－520（in Chinese）.

［16］ ZHANG H ZH（张慧智），LIU Y G（刘云国），HUANG B R（黄宝荣），etal.A survey of heavy－metal content in plants growing on the soil polluted by manganese mine tailings［J］.Chin.J.Ecol.（生态学杂志），2004，23（1）：111－113（in Chinese）.

［17］ LIAO Y（廖 阳），YAN R L（闫荣玲），GONG L J（龚令军），etal.Manganese ion enrichment law and physiological response inCamellia oleiferaseedlings［J］.J.HenanAgricul.Sci.（河南农业科学），2014，43（5）：48－51（in Chinese）.

［18］ BAKER A J M，BROOKS P R，PEASE A J，etal.Studies on copper and cobalt tolerance in three closey related taxa within the genusSilenceL.（Caryophyllaceae）from Zaire［J］.PlantandSoil，1983，73（3）：377－385.

［19］ XUE SH G（薛生国），CHEN Y X（陈英旭），LUO Y M（骆永明），etal.Manganese tolerance and hyperraccnulation ofPhytolaccaacinosaRoxb.［J］.ActaPedologiaSinica（土壤学报），2004，41（6）：889－895（in Chinese）.

［20］ YUAN M L，TIE B Q，TANG M ZH，etal.Accumulation and uptake of manganese in a hyperaccumulatorPhytolaccaamericana［J］.Min.Eng.，2007，20（2）：188－190.

［21］ XU X H（徐向华），SHI J Y（施积炎），CHEN X C（陈新才），etal.Subcellular distribution and chemical fractions of manganese in leaves of HyperaccumulatorPhytolaccaacinosaRoxb.［J］.J.Agro－EnvironmentSci.（农业环境科学学报），2008，27（2）：515－520（in Chinese）.

［22］ MORA M L，ROSAS A，RIBERA A，etal.Differential tolerance to Mn toxicity in perennial ryegrass genotypes：involvement of antioxidative enzymes and root exudation of carboxylates［J］.PlantandSoil，2009，320（1－2）：79－89.

［23］ Valérie P，Laure W，URS F.Heavy metals in white lupin：uptake，root－to－shoot transfer and redistribution within the plant［J］.NewPhytol.，2006，171（2）：329－341.

［24］ WANG H H（王海华），FENG T（冯 涛），PENG X X（彭喜旭），etal.Effects of manganese on antioxidant system of manganese－hyperaccumulatorPhytolaccaamericanaL.［J］.Chin.J.Appl.Ecol.（应用生态学报），2009，20（10）：2 481－2 486（in Chinese）.

［25］ HOU L P（侯雷平），WU J H（吴俊华），LI Y X（李远新）.The effect of lacing and overplus of manganese on the yield and the flavor quality of the fruit in the tomato［J］.J.Nucl.Agricul.Sci.（核农学报），2010，24（1）：83－87（in Chinese）.

［26］ CHEN X X（程昕昕），LIU ZH（刘 正）.Physiological effects of manganese on the germination of sweet corn［J］.Guihaia（广西植物），2013，33（2）：159－163（in Chinese）.

［27］ QIAO CH Y（乔传英），WANG H X（王红星），QIAO L（乔 琳），etal.Effect of the Fe and Zn on wheat seed germination and physiology［J］.J.GuangdongAgricul.Sci.（广东农业科学），2010，（2）：7－8（in Chinese）.