路易斯安那鸢尾LiPCS1基因克隆和表达分析

田松青，朱旭东，赵沿海，原海燕，顾春笋，黄苏珍

（1 苏州农业职业技术学院，江苏苏州215008；2 中国科学院 植物研究所南京中山植物园，南京210014；3.南京农业大学，南京210095）

植物络合素（phytochelatin，PCs）是以谷胱甘肽（GSH）为底物通过植物络合素合酶（phytochelatin synthase，PCS，包括PC2、PC3等）催化而成［1］，能与重金属结合成复合体而对重金属解毒起着重要作用［2－4］。目前植物络合素合酶基因（PCS）已在拟南芥［5］、小麦［1］、芥菜［6］、大蒜［7］、生菜［8］、百脉根［9］、豆梨［10］、蕃茄［11］、毛白杨［12］和湖北海棠［13］等植物中分离得到，已分离PCS的功能验证初步证明其在植物重金属铅螯合解毒过程起重要作用。过表达小麦络合素合酶基因（TaPCS1）的木立烟草（Nicotiana glaucaR.Graham）植株大大增加铅（Pb）耐受性，比野生型植物幼苗根长160%；生长在矿区土壤中的转基因植株的Pb浓度达1 572mg／kg，是野生型的2倍［14］。Lombi等［15］证明与PCs合成和络合相关的螯合Pb能增加耐Pb植物的耐性。Pb超富集植物水生蕨类Salviniaminima体内PCs的合成量与Pb积累量有着直接关系，推论植物螯合肽络合作用是 耐Pb机制之一［16］。香根草（Vetiveriazizanioides）在添加外源PCs 的条件下，体内形成PCs－Pb复合物，根和地上部可以累积到19 800 和3 350 mg／kg［17］。在矿区实地试验中发现，表达TaPCS1的欧美杂种山杨（Populustremula×tremuloides）品种‘Etrepole’转基因株系的总生物量及Pb积累量显著高于对照植株［18］。但是，不同物种植物螯合肽所起的作用差异较大，如PCs在蚕豆Pb耐性中所起作用很小［19］，Pb富集植物矿山生态型东南景天（Sedumalfredii）在Pb胁迫下没有诱导PCs合成［20］。在Pb 胁迫下金鱼藻（CeratophyllumdemersumL.）体内的GSH、Cys有所增加和诱导PC2、PC3螯合肽合成［21］。Gupta等［2］报道GSH（PCs的合成前体）在东南景天Pb 解毒的作用，虽然这一过程没有任何诱导PCs，这说明GSH在没有PCs 产生的条件下也能担任重要的解毒功能。

路易斯安那鸢尾（Louisiana iris）是一类观赏价值很高的宿根植物，具有一定的吸收和忍耐重金属Pb的能力［22］，目前相关路易斯安那鸢尾PCS基因的研究尚未见报道，且该基因在重金属Pb 螯合解毒等中的研究非常有限。本研究测定Pb处理前后根系、根状茎和叶片中Pb含量变化，探讨路易斯安那鸢尾吸收和忍耐重金属Pb的能力。并利用在转录组序列分析和RNA－Seq技术检测初步筛选出差异表达的易斯安那鸢尾LiPCS1 基因片段，通过RACE技术克隆获得全长，荧光定量RT－PCR 技术分析其不同时间Pb 处理和组织特异性表达，进一步验证其富集铅生长、结构［22］和生理生化［23］特性，为探讨路易斯安那鸢尾品种Pb富集耐性的分子机理机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验材料为路易斯安那鸢尾品种‘Professor Neil’，由美国引进。试验于2013年9月在南京中山植物园温室进行。

1.2 方 法

1.2.1 铅含量测定 选择生长一致的路易斯安那鸢尾分株苗，置于50% Hoagland营养液培养，30d后生根达3cm 以上长度后，移栽于2L 塑料盆，换成10% Hoagland营养液。Pb 以Pb（NO3）2形式加入，浓度分别为0、200、400及600 mg／L，重复3次，每周换1 次处理液。处理后1 个月取样，用HNO3－HClO4消化法和电感耦合等离子体原子发射光谱法（ICP，Perkin－Elmer 3300DV）测定植株体内各部分Pb 含量。采用Excel2010 和SPSS19 软件对试验数据进行统计和方差分析，用邓肯多重比较。

1.2.2 路易斯安那鸢尾LiPCS1基因克隆 （1）总RNA 提取 路易斯安那鸢尾幼苗用1／2 Hoagland营养液水培预培养30d，采集新鲜叶片和根系。根据Trizol plus试剂说明书，用新鲜叶片和根系提取总RNA。

（2）克隆LiPCS1基因中间序列 从路易斯安那鸢尾转录组数据中筛选出LiPCS1基因相关序列片段信息（comp152611＿c0＿seq5），根据GenBank中已登录的PCS同源基因的核苷酸和氨基酸序列，利用Clustal W 软件在线比对其序列同源性和分析保守区域；利用Primer 5和Oligo 7 软件根据转录组中的信息和网上保守区序列设计中间产物引物（表1）。使用逆转录酶合成DNA 第1 条链，即cDNA。再以cDNA 经PCR 反应扩增中间片段，扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s、50℃退火40s、72℃延伸50s，共32个循环；72℃延伸10min。PCR 扩增得到LiPCS1 基因中间产物并进行电泳切胶回收，然后连接到载体上，转化后对阳性克隆进行测序。

（3）LiPCS1 基因3′端序列的克隆利用Primer 5和Oligo 7 软件，根据测序获得的中间序列设计3′端特异PCR 引物（表1）。采用Clontech公 司 的SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit试剂盒获得该基因的3′端序列。

（4）LiPCS1 基因5′端序列的克隆利用Primer 5和Oligo 7软件，根据测序获得的中间序列设计5′端正向PCR 引物和反向特异PCR 引物（表1）。采用Invitrogen 公司的5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0试剂盒获得LiPCS1基因的5′端序列。

表1 基因克隆和qRT－PCR所用引物序列Table1 Primers used for gene cloning and qRT－PCR

（5）序列拼接 采用DNAMAN 软件对克隆得到的5′端、3′端和中间序列进行首尾拼接，得到LiPCS1基因的全序列。

1.2.3LiPCS1编码蛋白和生物信息学分析 使用Oligo 7 软件分析该基因编码的氨基酸序列。从NCBI数据库中选取与LiPCS1基因编码的氨基酸序列blastp相似度大于80%的植物同源氨基酸序列，通过Clustal W 软件分析LiPCS1 基因编码的氨基酸序列的保守性，并基于此基因编码的氨基酸序列、利用MEGA 6软件中的泊松分布模式构建相似植物的系统树。采用SOPMA 软件在线分析LiPCS1基因编码的蛋白质的二级结构，并通过TMHMM 2.0软件在线分析该蛋白质的跨膜结构域。将克隆到的LiPCS1基因序列采用MEGA6软件比对其亲缘关系。LiPCS1蛋白保守结构域通过pfam（http：／／pfam.xfam.org）在线分析完成。蛋白质三维结构预测在http：／／swissmodel.expasy.org 上进行，并通过http：／／www.ebi.ac.uk／Inter－ProScan 寻找该类蛋白在不同物种中的分布。

1.2.4LiPCS1 实时荧光定量PCR 收集路易斯安那鸢尾的根、茎、叶和花等不同组织的新鲜样品各3份，同时选取植株大小和长势一致的分株苗进行不同时间长度（0、1、3、6、12和24h）铅（浓度为200 mg／L）的处理，重复3次，处理后收集新鲜的根系和叶片。收集的样品于液氮中速冻，之后保存于－80 ℃超低温冰箱备用。使用试剂盒提取上述样品总RNA，用随机引物将RNA 反转录成cDNA，采用SYBR GREEN 染料法，以UBC 为内参基因，根据已克隆的基因序列用Premier 5.0软件设计特异性检测引物（表1），做相对定量检测。将毛细管置于定量PCR 仪（Roche公司）中，设定荧光采集通道以及读取荧光步骤，按照以下反应程序进行PCR 反应：94 ℃预变性30s；94 ℃变性20s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30s循环45次，72 ℃单点检测信号；最后加入溶解曲线程序：95℃0s，60℃15s，95℃0s，连续检测信号。相对转录水平采用2－△△Ct法进行计算。数据处理同1.2.1。

2 结果与分析

2.1 路易斯安那鸢尾对Pb的吸收

从图1可以看出，路易斯安那鸢尾根系、根状茎和叶片Pb 含量随Pb浓度的增加而增加，并以根系Pb含量最大，叶片最小。根系在低浓度200 mg／L Pb处理时积累量为33 050 mg／kg，与对照差异显著；而在Pb浓度400和600mg／L 时增加不显著，600mg／L 时达到最大值（36 255.8mg／kg）。根状茎在200mg／L Pb处理时与对照差异显著，在600 mg／L时达到最大（1 665mg／kg），各浓度处理都差异显著。叶片与根状茎接近，低浓度时对Pb 积累非常小，在Pb 200mg／L 时仅为64.6mg／kg，没有显著差异；在高浓度Pb 600 mg／L 时达到最大值（1 249.8mg／kg），与对照差异显著。

2.2 LiPCS1基因全长及生物学信息分析

2.2.1 基因全长及编码蛋白质 扩增到路易斯安那鸢尾LiPCS1基因的中间片段1 151bp（图2，a）。根据获得的中间片段序列，设计特异引物，3′－RACE扩增得到343bp 片段（图2，b）。5′－RACE扩增得到335bp片段（图2，c）。用DNAMAN 软件进行序列拼接后得到基因完整序列（图3），其总长1 683bp，GenBank登录号为KT347093，其开放阅读框（ORF）为1 503bp，5′非编码区76bp，3′非编码区105bp，预测编码蛋白质含501aa（图3）。

与其他植物PCS基因类似，路易斯安那鸢尾LiPCS1基因编码产物由N 端（4 个氨基酸）、保守区（208 个氨基酸）和C 端可变区（289 个氨基酸）组成，氨基端高度保守，共含18 个半胱氨酸（Cys）残基，其中含有Cys－56、His－162 和Asp－182等3个必需的氨基酸活性位点，它们组成催化三联体来起活性作用。C末端具有植物络合素合酶的重金属离子传感器基序C368C369RMTC373VRC376（图3）。

图1 Pb胁迫下路易斯安那鸢尾各器官中Pb含量Fig.1 Pb contents in different organs of Louisiana iris with Pb treatment

2.2.2 蛋白结构分析 路易斯安那鸢尾LiPCS1基因编码蛋白pfam 比对结果显示，它具有2 个典型的植物络合素亚家族结构域，该结构域是PCS 蛋白的典型特征结构，表明了克隆的路易斯安那鸢尾LiPCS1所编码的蛋白为植物络合素合酶。通过SOPMA 软件在线对路易斯安那鸢尾LiPCS1进行分析，路易斯安那鸢尾LiPCS1蛋白是由α螺旋、延伸链和不规则螺旋等结构元件组成，其中α螺旋占49.50%，延伸连占12.18%，不规则螺旋占38.32%。TMHMM 软件在线分析LiPCS1蛋白质不具有跨膜结构，不是膜蛋白。在http：／／swissmodel.expasy.org 上利用Automatic Modelling Mode预测了路易斯安那鸢尾LiPCS1蛋白的三维结构，同时与豆梨PcPCS1、拟南芥AtPCS1 和百脉根LjPCS1蛋白的三维结构［10］进行比较，认为这4个蛋白具备类似的空间构架。

2.2.3 蛋白质保守性及进化树分析 通过NCBI数据库直接搜索相关PCS1 氨基酸序列及利用LiPCS1序列采用blastp的方法，共从数据库中筛选出10种同源氨基酸序列：油棕Elaeisguineensis（XP＿010935936.1）、海枣Phoenixdactylifera（XP＿008810429.1）、大蒜Alliumsativum（AAO13809.1）、葡萄Vitisvinifera（XP＿002272237.2）、莲Nelumbonucifera（NP＿001289777.1）、蓖麻Ricinuscommunis（XP＿002529835.1）、小桐子Jatrophacurcas（XP ＿012085275.1）、甜 橙Citrussinensis（KDO60424.1）、拟南芥Arabidopsisthaliana（NP＿199220.1）和节节麦Aegilopstauschii（EMT23611.1）。利用Clustalw 软件分析同源氨基酸序列，其氨基酸相似位点占83.1%（图5中所有彩色部分字母表示氨基酸相似位点），氨基酸完全相同位点占34.0%（图5中黄色部分字母表示氨基酸完全相同位点）。分析结果同时显示，PCS1 蛋白N－端氨基酸保守性强，应该是功能区域，C－端氨基酸序列变异性变化较大。PCS普遍存在于微生物、动植物等不同物种中，表明不同物种共有PCS催化合成植物络合素的这一生物途径。

图2 LiPCS1基因PCR 产物凝胶电泳Fig.2 PCR gel electrophoresis of LiPCS1

图3 LiPCS1基因全长及编码氨基酸序列Fig.3 The full length of the LiPCS1gene and amino acid sequence

利用MEGA6分析这10种同源氨基酸序列同LiPCS1的进化关系（图4），反映了PCS1在植物进化方面有一定的亲缘关系一致性，如棕榈科（油棕和海枣）。路易斯安那鸢尾LiPCS1 与海枣和油棕关系最近，与其他植物关系较远。

2.3 LiPCS1不同组织表达特性分析

分别提取路易斯安那鸢尾根、茎、叶、外花瓣、内花瓣、雄蕊和雌蕊的总RNA，OD260／OD280在1.9～2.0间，表明RNA 纯度较好，可进行后续试验。如图6所示，LiPCS1不同组织表达量为：内花瓣＞雄蕊＞叶＞茎＞外花瓣＞根＞雌蕊，其中内花瓣最高，与其他组织有显著差异，雄蕊、叶和茎在同一表达水平，外花瓣、根和雌蕊表达较低，雌蕊最低。

2.4 LiPCS1响应Pb胁迫的表达特性分析

图4 LiPCS1同其他物种PCS1蛋白的进化分析Fig.4 Phylogenetic relationships between LiPCS1 and other plant PCS1s

铅处理0、1、3、6、12和24h后，分别提取路易斯安那鸢尾的根系和叶片的总RNA 后，进行荧光定量分析。如图7所示，路易斯安那鸢尾LiPCS1基因在根系和叶片组织中的转录水平不同，在叶片中表达普遍比在根系中表达高。随着铅处理时间增加，LiPCS1基因在根系和叶片中表达量都表现出先升高后下降的趋势，并均在铅处理3h达到最大值，产生显著差异，在24h时接近对照。

图6 LiPCS1在路易斯安那鸢尾各组织中的表达Fig.6 Different expression of LiPCS1in various tissues of Louisiana iris

图7 路易斯安那鸢尾LiPCS1受不同时间铅胁迫后的表达模式Fig.7 Different expression patterns of LiPCS1in the leaves and roots of Louisiana iris after different time treatments with Pb

3 讨 论

在Pb胁迫条件下，路易斯安那鸢尾‘Professor Neil’的根、根状茎和叶片，Pb最大吸收量分别达到36 255.8、1 665.0和1 249.8mg／kg，符合铅富集植物叶片或地上部（干重）含Pb达到1 000mg／kg 以上的条件，说明路易斯安那鸢尾具有一定的吸收和忍耐重金属铅的能力。路易斯安那鸢尾为成年分株苗，生物量大，特别是具有粗状的根状茎，积累了一定的营养，可能对植株逆境抗性等方面起着十分重要的作用。

重金属胁迫可诱导植物产生PCs并与之结合形成硫肽复合物，以降低对植物毒害。PCs的活性和植物耐重金属能力与PCs中的Cys残基的位置和排列方式关系密切［24－25］。本研究所克隆的路易斯安那鸢尾 LiPCS1 与 AtPCS1［5］、LjPCS1［9］和PcPCS1［10］等编码蛋白，都含有Cys56、His162和Asp182等3个必需的氨基酸活性位点，它们组成催化三联体起活性作用。其次，C 末端的CCXXXCXXC基序为植物络合素合酶的重金属离子传感器［26］，也与螯合重金属离子有关。AtPCS1、LjPCS1和PcPCS1表达蛋白分别表现为C358C359XXXC363XXC366、C368C369RETC373MKC376和C369C370QETC374VKC377，路易斯安那鸢尾LiPCS1 蛋白基序与LjPCS1一致的，这4个蛋白在生物体内可能行使类似的功能。Cys358、Cys359、Cys363和Cys366点突变后的AtPCS1蛋白，在Cd2＋或Zn2＋存在条件下，植物络合素合成能力下降［26］，从试验上证明了这一可能。

Ha等［5］研究AtPCS1基因在拟南芥中的表达规律时发现，无论Cd2＋是否存在，AtPCS1 在根部的表达丰度均显著高于叶片组织。与此略有不同的是，路易斯安那鸢尾LiPCS1在根中的表达丰度低于成熟叶片，表明PCS基因在不同植物之间具有不同的表达模式，叶片是路易斯安那鸢尾LiPCS1基因的主要合成部位，在开花时，内花瓣和雄蕊表达特别高。荧光定量PCR 分析表明，路易斯安那鸢尾LiPCS1基因受重金属铅胁迫诱导上调表达，其中在叶中的表达量显著增加，大于在根中的增加量，这与豆梨PcPCS1［10］、萝 卜RsPCS［27］和BnPCS1［28］基因的表达特征一致，而与小麦TaPCS1［28］的结果相反，这可能是因为路易斯安那鸢尾属多年生根茎类水生植物，叶的生命周期只有一个生长季节，新叶不断代替老叶，进而保持较高的活力。

以上结果表明，路易斯安那鸢尾LiPCS1在保护其免受重金属铅毒害的过程中可能起到一定作用，但基因上调的倍数较低，还需构建该基因的过表达载体，转化拟南芥等植物对其功能进行验证。

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