植物维生素B6从头合成与代谢转换研究进展

黄龙全，张剑韵

维生素B6（VB6）是一组可相互转换的吡啶衍生物的总称，包括吡哆醇（pyridoxine，PN）、吡哆胺（pyridoxamine，PM）、吡哆醛（pyridoxal，PL）、磷酸吡哆醇（pyridoxine 5′－phosphate，PNP）、磷酸吡哆胺（pyridoxamine 5′－phosphate，PMP）和磷酸吡哆醛（pyridoxal 5′－phosphate，PLP）。其 中，PLP 是140多种细胞酶的辅酶，在生物体内发挥广泛、重要的作用。植物和微生物是自然界VB6的制造者，动物从食物中获得VB6。在植物体内，PLP作为胱硫醚合成酶［1］、氨基环丙烷羧化物合成酶［2］、丝氨酸棕榈酰转移酶［3］、苏氨酸合成酶［4］、胱硫醚裂合酶［5］等的辅酶有详细研究；PLP 也是乙烯、叶绿素和生长素 合 成 所 必 需 的［6－7］；PLP 还 涉 及 亚 油 酸 和 淀 粉 的合成［8］。近年来发现VB6也是抗氧化剂，可有效淬灭单线态氧和超氧阴离子自由基［9－10］；它作为细胞信号传导的调节分子，对细胞膜上的离子通道具有调节作用［11］；它发挥抗逆作用，保护植物免受低温、紫外线、氧化、渗透压等环境胁迫的影响［12－13］。无论是阐明VB6参与调控植物生长发育和环境反应的机理，通过遗传改良提高食源性植物的VB6含量，还是利用VB6的特殊生理功能提高植物的逆境适应能力，都依赖于对VB6代谢的研究。植物VB6代谢包括VB6的从头合成和合成后的代谢转换。本文综述了植物VB6从头合成与代谢转换的研究进展。

1 植物VB6 的从头合成

1.1 自然界存在两种VB6 从头合成途径

至今发现两种VB6从头合成途径（de novo synthetic pathway），两者的底物、产物和作用酶均不相同。首先发现的DXP依赖途径（DXP dependent pathway）在大肠杆菌有详细研究，利用1－脱氧－D－木酮糖－5－磷酸（DXP）和4－磷酸羟基－苏氨酸首先合成PNP，再经PNP氧化酶的作用，转变为PLP后用于细胞代谢过程［14］。

另外一条途径DXP 非依赖途径（DXP independent pathway）于1999年发现。该途径以谷氨酰胺、3－磷酸甘油醛（或磷酸二羟丙酮）和5－磷酸核糖（或5－磷酸核酮糖）为底物直接合成PLP［15－17］（图1）。Ehrenshaft等［15］在研究尾孢菌（C.nicotianae）对自身毒素的抗性中发现了涉及VB6代谢的新基因，最初指定为单线态氧抗性基因SOR1，后来鉴定为PDX1。2001年又从尾孢菌鉴定出涉及VB6合成的第2 个基因PDX2［16］。目前已经明确PDX1和PDX2构成PLP合酶复合体（PLP synthase complex），PDX2发挥谷氨酰胺酶的作用，催化从谷氨酰胺产生氨；PDX1发挥闭环蛋白的作用，催化5－磷酸核糖、3－磷酸甘油醛和氨的缩合，完成PLP 的合成［17］。DXP非依赖途径的产物直接用于细胞代谢，生物效率高于DXP依赖途径，是自然界VB6的主要合成途径。DXP 非依赖途径通过谷氨酰胺将VB6和氨基酸代谢联系起来，通过丙糖和戊糖磷酸代谢池又将VB6与细胞能量途径联系起来。

1.2 植物通过DXP非依赖途径从头合成VB6

VB6合成途径作用酶及其编码基因的鉴定是极为重要的一歩。学术界很长时间认为植物通过DXP依赖途径合成VB6，但始终没有找到实验依据。作为植物逆境应答中VB6作用研究的一部分，2005年Denslow 等［18］从烟草鉴定出PDX1 和PDX2同源序列。使用兼并引物的基因扩增获得2个PDX1序列，彼此相差15个碱基，编码相同氨基酸序列，可能是2 个等位基因或者2 个拷贝。PDX2为单拷贝基因，表达也远低于PDX1。多个研究小组从拟南芥也鉴定出PDX1和PDX2同源序列，并开展了更为深入的研究［13，19－23］。目前已经明确植物通过DXP非依赖途径从头合成VB6。

图1 DXP非依赖性维生素B6 合成途径Fig.1 DXP independent vitamin B6synthetic pathway

拟南芥PDX2也是单拷贝基因，位于5号染色体上（At5g60540），基因长度为2 180bp，含有7个外显子，转录长度为768bp，编码255个氨基酸、理论分子量为27 303Da的蛋白。存在3个PDX1同系物，分别命名为AtPDX1.1、AtPDX1.2和AtPDX1.3。PDX1.1（At2g38230）、PDX1.2（At3g16050）和PDX1.3（At5g01410）分别位于2号、3号和5号染色体上。PDX1.1和PDX1.3具有89%的相似性，而与PDX1.2的相似性为60%。拟南芥还存在一个小的不完全拷贝（PDX1.4），其与PDX1.1基因上游序列33%相同，在细胞代谢中可能没有作用。PDX1同系物都没有基因内含子，提示其原核起源。PDX1.1、PDX1.2和PDX1.3的转录长度分别为1 053、1 380和1 297bp。PDX2对拟南芥的生长发育至关重要，突变体胚胎致死［19，23］。因为难以获得PDX2的纯合突变体，所以大量的研究集中 在PDX1同系物上［13，19－22］。其 中PDX1.3 的 转录丰度最高，突变体表型和VB6水平的变化最大，研究也最为详细。

PDX1.1基因沉默植物出现萎黄和根系生长不良，而PDX1.1和PDX1.3基因都沉默植物叶片萎黄畸形，多数死亡，幸存植物的花朵小、未能结籽，提 示PDX1.1 和PDX1.3可能存在功能重叠［21］。Titiz等［20］对PDX1.1 和PDX1.3 基因进行了TDNA 插入突变。pdx1.3突变体的表型与Wagner等的结果非常相似，但pdx1.1突变体的VB6水平没有下降，也不呈现萎黄表型。Titiz等也进行了PDX1.1和PDX1.3双突变，恶化的表型和致命的双突变也预示两基因至少部分功能重叠。但是，2个基因的时空表达存在差异［13，20－21］，提示两者也可能具有相对独立的功能，在拟南芥基因组中都有存在的意义。拟南芥PDX1.2的作用还不清楚，基因插入突变体的表型与野生型没有差异［21］。但拟南芥遭遇紫外线和氧化胁迫时PDX1.2转录上调［22］，提示PDX1.2可能在胁迫条件下发挥作用。

1.3 植物VB6 的从头合成涉及逆境应答

烟草感染假单胞杆菌后PDX1和PDX2的基因表达下调，而水杨酸和茉莉酮酸甲酯处理可致基因短暂上调［18］。Chen等［13］在分离干旱和盐胁迫响应蛋白互作伴侣的酵母双杂交实验中，首先分离出PDX1.3。植物的根、茎、叶、花和长角果都能检测出PDX1.3的转录，基因的最强表达出现在脉管组织和保卫细胞。pdx1.3突变体的叶绿体和根的生长异常，幼苗的根对盐和甘露醇敏感，提示PDX1.3蛋白涉及对渗透和离子胁迫的生物应答。pdx1.3突变体根部缺乏色氨酸依赖性生长素的合成，这可能是出现短根表型的原因［24］。2006年，Wagner等［21］获得了PDX1.3基因EMS 突变体rsr4－1，突变体的蔗糖响应下降，呈现根生长退化、矮小和退绿叶。突变体的表型可以采用向生长媒体中添加PL 的方法加以恢复，添加PN、PM 或者PLP可部分恢复。

Denslow 等［22］报道了非生物胁迫下拟南芥PLP合酶基因的应答调节。正常状态下，拟南芥PDX1.1和PDX1.3高水平表达，PDX1.2不表达或低水平表达，PDX2中间水平表达。在植物遭遇强光、低温、干旱、紫外线、百草枯和臭氧时，PDX1和PDX2基因都上调。作者进一步分析多种胁迫因子对烟草VB6存在形态的影响，发现PLP 水平不同程度地应答上升，并引起PL 和PN 的相应变化，随后回归对照水平［25］。

2007年Herrero 等［26］在烟草中表达尾孢菌PLP合成酶基因，尝试提高烟草的VB6含量。结果仅有一个株系VB6水平的增加达到显著水平，比野生型和转化对照系高出约17%。然而，转化系烟草内源PDX1和PDX2 基因的表达下降，提示植物VB6的从头合成受到严格调控。2011年，Raschke等［27］在拟南芥过量表达PDX 蛋白，获得了VB6含量显著增加的植株。他们还发现仅能提高PDX1的蛋白表达量，高VB6含量植株的生长期延长，细胞体积增大，对氧化胁迫的抵抗性也增强。

1.4 VB6 从头合成途径的细胞定位

PDX1和PDX2 复合体的细胞定位还存在争议。Tambasco－Studart等报道所有PDX1和PDX2蛋白都定位于细胞溶质［19］。然而，Chen 等［13］把PDX1.3定位于细胞器和膜系统。Denslow 等［21］也报道能够从质膜和细胞核观察到PDX2 蛋白。从SUBA 拟南芥亚细胞定位数据库汇总的亚细胞定位信息看，PDX1和PDX2定位于细胞溶质和细胞器。基于预测程序，PDX1.1、PDX1.3 和PDX2定位于细胞溶质、线粒体和质体，PDX1.2定位于细胞溶质和线粒体。

2 植物VB6 从头合成后的代谢转换

除了VB6的从头合成，细菌和真核生物细胞中还普遍存在一条相似的PLP补救途径，补救途径涉及一系列酶的作用，通过VB6各型的代谢转换使得细胞能够直接利用外源PN、PM 或PL来合成细胞代谢所需要的PLP。补救途径在微生物和哺乳动物有详细研究。虽然PLP是占优势的辅酶型，其他形式的VB6在细胞中通过补救途径也保持动态平衡。

2.1 植物PL激酶

PL激酶（PL kinase，EC 2.7.1.35）在金属阳离子的存在下，利用ATP催化PL、PN 和PM 的5′位醇基磷酸化，生成相应的磷酸酯型。从大肠杆菌发现两种PL 激酶，pdxk 基因编码普通PL 激酶，而pdxy 基因编码的特殊PL 激酶仅以PL 为底物，且活性很低［28－29］。目前，真核生物中仅发现pdxk 基因，而多数原核生物同时具有pdxk和pdxy。

2002、2004和2008年，分别从拟南芥［30］、小麦［31］和油菜［32］克隆出PL 激酶基因。从拟南芥鉴定出的At5g37850与大肠杆菌pdxk 同源，与哺乳动物PL 激酶氨基酸序列的相似性大于40%。At5g37850也称SOS4，其突变体对盐高度敏感。拟南芥SOS4基因在叶、茎、根和花均等表达，根尖高度表达，种子吸水60h后可检测出PL 激酶基因的表达。小麦基因组至少有2个PL 激酶拷贝，在根、芽、穗和花药均有转录。油菜也有2 个PL 激酶拷贝，基因的转录受发育和环境的调节。目前还缺乏采用实验的方法对PL 激酶进行细胞定位，预测结果表示存在于质体和线粒体。

拟南芥SOS4基因突变的研究证明PL 激酶是一个新的盐耐受性决定因子，其突变体sos4 萎黄，与野生型相比植株重量减轻，根部对蔗糖和盐高度敏感，存在NaCl时根的生长严重受损；突变体出乎预料地出现了VB6积累，其中PLP 的增加量最为显著，其次是PN 和PM［33］。PLP 的增加可能是因为从头合成途径基因的上调，因为sos4 突变体PDX 基因的转录量比野生型的高。除了对盐和蔗糖敏感，sos4突变体耐旱而不耐寒。最近发现叶绿体依靠PL激酶维持磷酸酯型VB6水平［34］。

2.2 植物PNP氧化酶

补救途径的另一个重要酶是FMN 依赖性PNP氧化酶（PNP oxidase，EC 1.4.3.5），氧化底物PNP和PMP上的4′位醇基或氨基为醛基，生成PLP。2007年克隆出拟南芥At5g49970基因，编码蛋白由3个部分构成，N 端为叶绿体转运肽，中部为未知功能的Yjef＿N 区域，C 端为PNP氧化酶（PDX3）［35］。Sang等［35］在大肠杆菌中表达该基因，通过酶活性分析证明了其功能。拟南芥PNP氧化酶在不同组织中的表达存在差异，受光、热、ABA 和乙烯处理的上调，受干旱和NaCl的下调。生物信息学预测PNP 氧化酶定位于叶绿体，也获得了GFT－AtPPOX 融合实验的支持。Gonzalez等［33］采用对大肠杆菌pdxh 突变体的互补实验，也验证了拟南芥At5g49970的PNP氧化酶功能。他们还对该基因进行了插入突变，2个独立插入突变系氧化酶的活力均下降。pdx3 突变体的VB6总水平下降，而VB6各型与野生型相比较没有显著差异。生长在标准室内环境中的pdx3 突变体比野生型对照矮小。高光照条件下，pdx3 突变体对增强的光照反应迟钝，植株重量无变化，而野生型在强光照条件下生长量增加。突变体对低温、盐与蔗糖引起的渗透压响应与野生型无区别。pdx3 突变体的SOS4以及从头合成途径基因，特别是PDX1.1基因的表达增强。虽然从头合成途径基因的表达增加，但pdx3突变体与野生型或者sos4突变体相比较，PDX1的酶活力下降。2011年Sang等［36］又报道PNP 氧化酶在细胞溶质和叶绿体中将PNP 和PMP 氧化为PLP。

2.3 植物PL还原酶

PL还原酶（PL reductase，EC 1.1.1.65）也称为PN 脱氢酶，利用NADPH 将PL 还原成PN，反应在体外是可逆的，但在体内逆反应几乎不可能发生。2004年，Morita等［37］发现裂殖酵母PL 还原酶基因突变体能够在缺乏VB6的合成培养基上生长，认为该酶对酵母生存而言是非必要的，仅涉及PL转变为PN 后的细胞排出。

2011年，采用序列同源比对的方法从拟南芥鉴定出PL 还原酶（PLR1），在酵母PL 还原酶缺失突变体中表达AtPLR1 编码区域，验证了该酶催化NADPH 依赖性PL 的 还 原 反 应［38］。采 用T－DNA插入突变的研究发现，plr1突变体VB6从头合成途径基因的表达水平变化不大，而补救途径作用酶PDX3和SOS4 基因的表达发生显著变化。并且，pdx3和sos4突变体AtPLR1 基因的表达也上调。高效液相色谱的分析结果显示，2 个plr1 突变体VB6总水平下降，其中PL、PLP、PM 和PMP 水平显著下降，而PN 和PNP 没有显著变化。突变体PL水平下降和PN 水平没有变化是很意外的，提示AtPLR1基因的表达产物可能不是唯一的PL 还原反应的作用酶。突变体的根系生长正常，但植株明显小于野生型；对低温和高光照的抵抗性与野生型没有差异，但明显受NaCl和甘露醇的抑制，提示PL还原酶也可能涉及植物对渗透胁迫的抵抗性。

植物的叶际是一个复杂的生态系统，具有丰富的微生物多样性。这些微生物改变植物体表微环境和参与物质循环。VB6是水溶性维生素，其跨膜转移已有广泛的研究，很早就明确只有非磷酸酯型VB6能够穿越细胞膜。植物即可以从环境中吸收VB6，过量VB6也向环境释放［39］。我们发现叶际微生物在烟草叶面可以将来源于叶组织的PL 还原为PN，提示植物PL 的还原可能还存在叶际微生物的作用［40］。

2.4 烟草VB6 的代谢转换与调控

作为重要经济作物和模式植物，烟草VB6从头合成途径最早被阐明。我们以组培烟草为材料构建无菌实验模型，解析了植物体内VB6的代谢转换，获得了代谢转换的重要调控信息。采用底物（PL、PM 和PN）饲喂和应答分析的研究发现，烟草叶片组织中PLP保持稳定、PL 水平受到控制，PL 还原为PN 以及PM 与PL的相互转化是VB6代谢转换的重要内容［39］。在建立以HPLC 检测为基础的VB6代谢酶活性检测方法的基础上，从烟草叶片组织鉴定出PL激酶、PNP氧化酶、PL还原酶，以及酶促PM－PL转换和PLP 水解脱磷酸反应，在体外最适反应条件下，叶片组织粗提液中这些酶的催化活力分别为0.15、0.10、0.08、0.64和23.08nmol·min－1·mg－1，在代谢酶活力水平上探讨了植物体内VB6的代谢转换［41］。我们的研究结果提示PLP→PL→PN 是植物（烟草）体内VB6从头合成后代谢转换的主体流向，PL 激酶和PNP氧化酶构成的PLP补救合成以及酶促PM 和PL 的相互转换是VB6主体代谢的补充（图2）。

2.5 烟草PLP磷酸酶的初步鉴定

PLP的水解在动物和微生物有详细研究，受特异和非特异性磷酸酶的作用。碱性磷酸酶涉及维持细胞外PLP浓度的稳定，而酸性磷酸酶涉及细胞内PLP浓度的稳定。1992年从人红细胞纯化出特异性PLP磷酸酶［42］，2003年从人脑克隆出PLP 磷酸酶基因［43］，从老鼠组织cDNA中也克隆出PLP 磷酸酶基因。我们以PLP为底物，从烟草纯化出水解PLP、PMP和PNP的磷酸酶。该酶为二聚体结构、分子量约为50kD，是一个新的非特异性酸性磷酸酶［44］。植物体内是否存在特异性PLP 磷酸酶还有待进一步的研究。

2.6 烟草PL和PM 相互转换作用酶的初步鉴定

很早就发现某些生物体内存在PL 和PM 的相互转换。从大肠杆菌和兔肝纯化出PM－草酰乙酸转氨酶，该酶可逆性地催化PM 和草酰乙酸、PL 和天冬氨酸之间的转氨反应，但是最终被认为是一个未知转氨酶的脱辅基形式［45］。因为该文作者发现从猪心纯化出的谷氨酸－草酰乙酸转氨酶在脱去辅酶PLP或者PMP后，也能够催化PM 和酮酸之间的转氨反应。PM－丙酮酸转氨酶（PM－pyruvate aminotransferase，EC 2.6.1.30）和PMP－α－酮戊二酸转氨酶（PMP－α－ketoglutarateaminotranferase，EC2.6.1.54）是目前已经明确和仅有的PLP非依赖性转氨酶，特异性地以VB6为底物而非辅酶，参与VB6代谢转换［46－47］。我们在发现烟草体内存在PM 和PL相互转换的基础上，进一步纯化出其作用酶。结果表示烟草体内存在PM－丙酮酸转氨酶，对PM 和PL的相互转换发挥主导作用，同时也明确烟草的谷氨酸－草酰乙酸转氨酶在脱去辅酶后，能够催化PM 和草酰乙酸或者α－酮戊二酸之间的转氨反应［48］。

图2 烟草体内维生素B6 代谢转换示意图［39］Fig.2 Postulated interconversions of different vitamin B6forms in tobacco plants［39］Thick arrow shows the predominant VB6 metabolic flux

3 展 望

植物合成的VB6对植物自身的生长发育和逆境适应，以及人和动物营养具有重要意义。植物VB6从头合成途径已经明确，研究积累也较丰富，而代谢转换尚未明了，还有许多不明之处。PN 葡糖苷（PN glucoside）是植物体内特有的VB6衍生物［49］，可能受UDP－葡萄糖依赖性葡糖基转移酶（UDP－glucose－dependentglucosyltransferase）的 作用由PN 生成。植物体内水解PLP、PMP 和PNP的磷酸酶、PM－丙酮酸转氨酶以及催化生成PN 葡糖苷的葡糖基转移酶，都还需要在基因水平上加以明确。虽然从拟南芥鉴定出PL 还原酶基因，但T－DNA插入突变的研究结果显示该基因的表达产物不是唯一的作用酶［37］。植物体内PL 的还原和PN 的形成还需要更加深入的研究。

同时，从植物检出4－吡哆酸（4－pyridoxic acid）［50］，尽管其起源和去向还是未解之谜，但提出了VB6的异化问题。因为4－吡哆酸在哺乳动物是排泄型VB6，在微生物是VB6降解途径的一个中间产物。至今从细菌发现两种VB6降解途径，PM－丙酮酸转氨酶是降解途径Ⅰ的重要作用酶［51］。从烟草分离出PM－丙酮酸转氨酶，暗示植物体内可能存在VB6降解途径Ⅰ。对植物VB6降解的研究具有重要意义，是VB6代谢平衡机制的重要内容，还将为今后通过基因工程技术提高食源性植物的VB6含量提供靶标基因。

另外，植物的质体、线粒体和过氧化物酶体等都存在重要的PLP依赖酶，这些酶的活力受制于细胞器内PLP 的平衡供给。PLP 不能通过质膜，并且PLP的4′位醛基非常活泼，极易与伯胺和仲胺形成醛亚胺结构。PLP与非VB6蛋白的非特异性结合将导致生理功能的紊乱。因此，植物VB6从头合成与代谢转换的调控机制也是亟待研究的重要科学问题。

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