塞来昔布联合放疗对人胆管癌细胞凋亡的作用研究

王阳 邹明雷 吕晶晶 付培彪

[摘要] 目的 研究人胆管癌细胞在塞来昔布和放疗作用下发生凋亡的作用机制。 方法 将QBC939细胞株分为四组：对照组、塞来昔布组（C组）、放疗组（R组）和塞来昔布联合放疗组（C+R组，联合组），分别进行不同浓度的塞来昔布和不同剂量X线作用后，采用CCK-8法、流式细胞技术和Western blot等方法分别检测各组细胞生长、凋亡率及survivin蛋白的表达。 结果 联合组的凋亡率明显增加，从3.527%升至23.364%（P<0.05），survivin蛋白表达明显降低（P<0.05）。 结论 应用塞来昔布对接受放疗的人QBC939细胞株有凋亡增敏作用，下调survivin的表达是其机制之一。

[关键词] 塞来昔布；胆管细胞癌；放疗；survivin基因

[中图分类号] R735.8 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2015）10-0019-03

胆管细胞癌是胆道系统常见的恶性肿瘤，因其解剖位置特殊，早期诊断较困难，可手术切除的患者不到20%，放化疗是中晚期患者主要治疗手段，但放疗效果受到肿瘤敏感性的限制。塞来昔布作为一种COX-2抑制剂，在近年研究中被认为具有抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的作用[1，2]。本研究探讨体外条件下塞来昔布对接受X线放疗的人QBC939细胞凋亡的作用及可能机制。

1 材料与方法

1.1 材料及细胞培养

QBC939人胆管癌细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库，塞来昔布购自南京德宝生化有限公司，细胞培养基为含10%胎牛血清的1640培养基，兔抗人survivin多克隆抗体及β-actin购自Santa-Cruz公司，CCK-8试剂盒、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物科技研究所。细胞培养条件：37℃、5%CO2的培养箱。实验设计及研究时间2012年1月～2013年1月。

1.2 CCK-8法检测细胞生长

取传代培养的对数生长期QBC，939细胞制成1×105个/L细胞悬液，种植在96孔板中，每孔100 μL。设为调零组（不含细胞的培养液），对照组（常规培养细胞，不接受塞来昔布及放疗），实验组（分别加入浓度为25 μmol/L、50 μmol/L、75 μmol/L、100 μmol/L的塞来昔布，X线放疗剂量分别为2 Gy、4 Gy、6 Gy、8 Gy、10 Gy），实验组每组设10个复孔。培养48 h后实验组每孔加CCK-8试剂10 μL，再培养2 h后，用酶标仪在450 nm波长下测定每孔的吸光度，计算细胞增殖抑制率，并进一步计算出塞来昔布的IC50=64.2 μmol/L。在后续实验中选择浓度65 μmol/L塞来昔布。X线放疗的IC50为5.83 Gy，选择剂量6 Gy用于后续实验。抑制率=（1-实验孔OD值/对照孔OD值）×100%。

1.3 流式细胞术检测

将实验分为四组，每组样本数为10，分组设置如下：对照组单纯培养细胞；塞来昔布组（C组）加入浓度65 μmol/L塞来昔布；放疗组（R组）给予剂量6 Gy X线照射；塞来昔布联合放疗组（C+R组）先给予浓度65 μmol/L塞来昔布24 h后更换培养液，再给予剂量6 Gy的X线照射细胞，各组细胞均培养48 h，收集细胞并离心，按试剂盒说明书进行检测，凋亡细胞的比例由Cell Quest Pro 软件计算，实验重复3次。

1.4 Western blot蛋白检测

收集上述各组细胞，每组样本数为10，加入细胞裂解液，提取总蛋白，调整各组总蛋白，使各组总蛋白浓度相同。经15%SDS-PAGE电泳后电转移至PVDF膜，封闭后加入一抗（兔抗人survivin多克隆抗体），工作浓度为1∶1000，再加入二抗（辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体），工作浓度为1∶6000。同样方法进行内参蛋白（β-actin）的抗体孵育。发光、显影、定影后制成胶片，扫描后用凝胶图像处理体统分析目标条带的净光密度值。

1.5 统计学分析

采用SPSS18.0统计学软件进行处理，计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 细胞的凋亡率

如图1所示每组细胞的流式图，结果显示联合组的凋亡率明显高于对照组、塞来昔布组及放疗组（P<0.05，见表1）。结合图1及表1结果，推断塞来昔布对QBC939的X线放疗有增敏作用。

2.2 Survivin蛋白的表达

联合组survivin蛋白表达较其他各组要明显减弱（图2），用相关软件计算出各条带的灰度值，将目的蛋白survivin/β-actin灰度值作为最终结果，以x±s表示（表1），多组之间比较差异有统计学意义（P<0.05），提示联合组survivin蛋白表达下降，从而加速细胞凋亡。

3 讨论

放射疗法作为治疗肿瘤的一种传统手段，其疗效受到肿瘤放疗敏感性的限制。目前研究发现大部分肿瘤对辐射并不敏感，在很大程度上影响了放疗效果。如何通过提高肿瘤的放射敏感性以提高放疗疗效，是近年来研究的热门之一。塞来昔布是一种环氧化酶-2（COX-2）选择性抑制剂，其放射增敏作用在近年研究中受到重视[2-4]。研究发现，环氧合酶-2（COX-2）在上皮组织癌（包括胃癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌、皮肤的鳞状上皮细胞癌等）中广泛存在且过度表达，在肿瘤的发生、发展中起着重要作用[4]。COX-2促进前列腺素E2（PGE2）生成，而PGE2具有放射保护作用，而放射治疗在杀灭肿瘤细胞的同时诱导肿瘤细胞高表达COX-2[4，5]。塞来昔布属于非甾体类抗炎药（NSAIDs），是一种选择性环氧化酶抑制剂，可通过抑制环氧化酶-1及环氧化酶-2来阻止花生四烯酸向前列腺素转化，从而阻止PGE2的放射保护作用，发挥放射增敏剂的作用。研究发现，塞来昔布作为一种新型COX-2选择性抑制剂，可明显降低消化道肿瘤的发病率[4]，塞来昔布通过抑制肿瘤细胞放射损伤的修复，改变肿瘤细胞的周期分布，抑制肿瘤新生血管形成以及诱导肿瘤细胞凋亡等机制，在联合放射治疗可提高放疗疗效，增强肿瘤细胞对放射的敏感性[5-7]。聂亮琴[7]等将正常少突胶质细胞（oln93）及脑胶质瘤细胞（u373）分别按空白处理、单独接受塞来昔布或X射线、塞来昔布联合X射线4种不同处理方式研究塞来昔布的放射增敏作用及其作用机制，发现塞来昔布能抑制oln93细胞和u373细胞生长，胶质瘤细胞组放射增敏比高于正常胶质细胞组，并诱导胶质瘤细胞G0/G1期阻滞，联合组与照射组比较，u373细胞发生G2/M期阻滞，Cyclin B1、DNA-PKcs、MRE1l蛋白表达下降，提示塞来昔布对u373的放射增敏作用比oln93细胞明显，其机制与调节细胞周期分布及DNA损伤修复有关。

Survivin基因作为凋亡抑制家族的重要成员，是目前发现最强的凋亡抑制基因，survivin表达与肿瘤预后、放化疗敏感性密切相关[8-11]。survivin与环氧化酶-2表达的关系是塞来昔布作用机制研究的方向之一。夏历[12]等研究发现在胃癌组织中survivin的表达与COX-2相关。李伟忠等[13]通过研究环氧化酶-2抑制剂塞来昔布对人舌鳞癌Tca8113细胞COX-2、survivin表达的影响及诱导细胞凋亡的作用，发现塞来昔布下调survivin mRNA及其蛋白表达的同时抑制COX-2蛋白的表达，但对COX-2 mRNA表达的抑制作用较弱，提示COX-2抑制剂塞来昔布下调survivin表达的作用可能与抑制肿瘤细胞生长等作用有关。方雷[14]等通过设计合成survivin 的 siRNA 序列并转染等方式研究survivin基因沉默对人胃癌MGC-803细胞增殖及对化疗药物塞来昔布敏感性的影响，发现 survivin基因沉默48 h后，MGC-803细胞的survivin基因和蛋白表达明显降低（P<0.05），survivin基因沉默组细胞对塞来昔布的敏感性显著增强，提示survivin特异性siRNA能显著沉默MGC-803细胞survivin基因，抑制细胞增殖，并增强MGC-803细胞对塞来昔布的敏感性。

使用塞来昔布来降低survivin的表达从而增加放疗的敏感性是本研究的设想之一。有研究发现在肝细胞癌中，PGE2可以激活EGFR/PI3K途径，通过EP1受体来上调survivin的表达[15]。本研究中，Western blot法检测到survivin蛋白的表达在联合组中明显下降，提示在QBC939细胞株中，塞来昔布可以加速survivin蛋白的分解或降低survivin的mRNA表达。本研究结果显示，联合组的凋亡率明显高于对照组、塞来昔布组及放疗组，由此我们可以推断，塞来昔布可以下调survivin表达，发挥放疗增敏作用。

本研究通过塞来昔布联合放疗作用于人胆管癌QBC939细胞株，显示塞来昔布能增强放疗的敏感性，提高肿瘤细胞凋亡率，其机制之一可能是抑制survivin表达。本研究对胆管癌的治疗提供了一种新思路，但是仍需更多研究来证实。

[参考文献]

[1] 许燕艳，翟凤钰，王亚帝，等. 塞来昔布联合多西他赛抑制人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和诱导凋亡的作用研究[J]. 中国全科医学，2013，16（3）：1004-1007.

[2] 周任，张龙洲，王睿智. 塞来昔布对胶质瘤U251细胞增殖、凋亡和Survivin表达的影响[J]. 癌症，2010，29（3）：316-322.

[3] 牛国梁，王辉，谢荣俊，等. 选择性COX-2抑制剂塞来昔布对乳腺癌的放疗增敏作用及其机制研究[J]. 肿瘤学杂志，2011，17（3）：172-176.

[4] 周海存，刘宏斌. 塞来昔布防治胃癌的机制及应用前景[J].中华消化外科杂志，2013，（4）：317-320.

[5] Davis TW，O'Neal JM，Pagel MD，et al. Synergy between celecoxib and radiotherapy results from inhibition of cyclooxygenase-2-derived prostaglandin E2，a survival factor for tumor and associated vasculature[J]. Cancer Res，2004，64（1）：279-285.

[6] Milas L. Cyclooxygenase-2 （COX-2） enzyme inhibitors and radiotherapy： Preclinical basis[J]. Am J Clin Oncol，2003， 26（4）：66-69.

[7] 聂亮琴，周菊英，王利利. 塞来昔布对正常脑胶质细胞和脑胶质瘤细胞放射增敏效应的比较及其机制[J]. 中华放射医学与防护杂志，2014，34（5）：342-344，375.

[8] 卢浩，刘士维，张伟. 凋亡抑制因子 Survivin 的研究进展[J]. 山东医药，2014，54（21）：100-101.

[9] 朱正明，欧阳喜，罗洪亮，等. Survivin基因启动子区多态性与结肠癌易感性及临床意义的相关性[J]. 世界华人消化杂志，2014，22（9）：1334-1340.

[10] 王璟，庞义存，赵向寨. survivin基因在绒毛膜癌细胞中的表达及对细胞增殖、凋亡的影响[J]. 中华妇产科杂志，2014，49（6）：466-468.

[11] 王平，董德平，张建平.下调survivin基因对膀胱尿路上皮癌T24细胞增生和凋亡的影响[J]. 中华实验外科杂志，2013，30（12）： 2521-2524.

[12] 夏历，谢小兵，宁兴旺. Survivin和COX-2在胃癌组织中的表达及其相关性[J]. 现代生物医学进展，2010，10（10）：1916-1919.

[13] 李伟忠，王晓燕，霍秋菊. 塞来昔布对人舌鳞癌Tca8113细胞survivin表达与诱导细胞凋亡的作用[J]. 广东医学杂志，2010，31（5）：543-545.

[14] 方雷，吴海滨，陈晓岗. Survivin 基因沉默抑制胃癌 MGC-803 细胞增殖并增强其对塞来昔布的敏感性[J]. 南方医科大学学报，2011，31（11）：1944-1948.

[15] Bai XM，Jiang H，Ding JX，et al. Prostaglandin E2 upregulates survivin expression via the EP1 receptor in hepatocellular carcinoma cells[J]. Life Sciences，2010，（86）：214-223.

（收稿日期：2015-01-09）