华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶基因DaGSTe1的克隆与表达

马俊宁，代鲁鲁，张然然，陈 辉

(西北农林科技大学 林学院，陕西 杨凌 712100)

华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶基因DaGSTe1的克隆与表达

马俊宁，代鲁鲁，张然然，陈 辉

(西北农林科技大学 林学院，陕西 杨凌 712100)

【目的】 克隆华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶基因的全长序列，并对其序列特征及不同发育时期的表达规律进行研究，以揭示谷胱甘肽S-转移酶在华山松大小蠹克服寄主抗性及物质转运过程中的分子调控机制。【方法】 采用RT-PCR和RACE克隆华山松大小蠹谷胱甘肽S-转酶基因全长cDNA序列，用实时荧光定量PCR检测该基因在华山松大小蠹幼虫、蛹和雌雄成虫中的表达情况。【结果】 获得cDNA全长为973 bp的华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶基因，并命名为DaGSTe1(GenBank登录号：KJ637332)，其编码一个由218个氨基酸组成的多肽，分子质量约为23.567 ku，理论等电点为7.90。华山松大小蠹DaGSTe1与山松大小蠹DpGSTe1氨基酸序列的相似度最高，达94%。根据对系统发育树的分析推测，DaGSTe1属于Epsilon 类谷胱甘肽S-转移酶。DaGSTe1蛋白三维结构包括一个N端结构域和一个C端结构域，其中N端结构域包括典型的4个β片层和3个α螺旋(β1α1β2α2β3β4α3)，C端结构域包括5个α螺旋(α4α5α6α7α8)。DaGSTe1基因在华山松大小蠹不同发育期均有表达，其中在雄性成虫中的表达量最大，为幼虫和蛹的8倍，雌性成虫的4倍。【结论】 克隆得到了华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶家族基因DaGSTe1，推测该基因具有降解寄主毒素的作用，而且参与华山松大小蠹雄性特异性激素的转运过程。

华山松大小蠹；谷胱甘肽S-转移酶；基因克隆；发育阶段

华山松大小蠹(DendroctonusarmandiTsai et Li)是我国特有的初期性害虫，主要危害30年以上的健康华山松，严重影响秦岭巴山林区森林生态系统的可持续发展[1]。华山松大小蠹除了在迁飞时期寻找新的寄主外，其生活史都是在寄主树木韧皮部内部完成的。小蠹科害虫选择入侵寄主的过程中，必须克服寄主树木的组成型(Constitutive)或诱导型(Induced)抗性。针叶树木分泌的树脂成分主要包括单萜、倍半萜、二萜和酚类物质，这些有毒化合物可以导致小蠹虫不同器官和组织的损坏，从而使其最终死亡，因此树脂的分泌在针叶树寄主防御和抵抗小蠹虫入侵方面起重要的作用[2-3]。然而小蠹虫自身具有相应的防御机制来降解有毒化合物，其中细胞色素P450、酯酶和谷胱甘肽S-转移酶(GST)这三大类多基因家族酶类的降解作用最为突出[4]。

谷胱甘肽S-转移酶家族是一类普遍存在于动物、植物、微生物体内的一类超家族酶类，能够转化降解多种天然和人工合成的化合物。昆虫体内包括Delta、Epsilon、Omega、Sigma、Theta 和Zeta 6类细胞质GST和1类微粒体(Microsomal)GST，其中Delta和Epsilon家族是昆虫所特有且被认为参与昆虫解毒反应的2个GST家族，其通过催化内源还原性谷胱甘肽(GSH)与各种有害的亲电性底物相结合，并增加有害亲电性底物的可溶性，从而使其从细胞内排出，进而保护生物体内的核酸和蛋白质免受亲电基团攻击[5]。此外，GST还具有转运胞内多种激素物质和外源代谢物的作用[6]。到目前为止，谷胱甘肽S-转移酶基因已经在黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)[7]、家蝇(Muscadomestica)[8]、冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)[9]、大劣按蚊(Anophelsdirus)[10]、褐飞虱(Nilaparvatalugens)[11]、德国小蠊(Blattellagermanica)[12]、小菜蛾(Plutellaxylostella)[13]、红火蚁(Solenopsisinvicta)[14]和烟草粉虱(Bemisiatabaci)[15]等多种昆虫中克隆和表达。小蠹科昆虫GST基因的研究还仅限于转录组测序完成的云南纵坑切梢小蠹(Tomicusyunnanensis)[16]和基因组测序完成的山松大小蠹(Dendroctonusponderosae)[17]，但对华山松大小蠹GST基因的克隆与表达尚无相关报道。

本研究应用RT-PCR、RACE和Real time-PCR技术对华山松大小蠹GST基因进行同源克隆，并检测其在不同发育阶段的表达情况，旨在揭示谷胱甘肽S-转移酶在华山松大小蠹降解华山松毒素和物质转运过程中的分子调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料与主要试剂

华山松大小蠹采自秦岭火地塘林场内的华山松被害木。UNlQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Promega T-easy克隆载体，购自北京奥科鼎盛生物科技有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒，购自北京百泰克生物技术有限公司；PrimeScriptTMⅡ Reverse Transcriptase反转录试剂盒、Taq酶、荧光定量PCR试剂盒、大肠杆菌DH5α感受态细胞，购自宝生物工程(大连)有限公司；RACE试剂盒，购自Clontech公司。

1.2 华山松大小蠹总RNA的提取和cDNA第一链的合成

取3只活的华山松大小蠹成虫，先用体积分数75%乙醇冲洗2次，然后用蒸馏水冲洗1次，放滤纸上干燥后，用液氮研磨充分，加入0.5 mL Trizol，用匀浆器匀浆处理，然后按照UNlQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒说明提取华山松大小蠹成虫总RNA，按PrimeScriptTMⅡ Reverse Transcriptase反转录试剂盒操作步骤合成cDNA第一链。

1.3 华山松大小蠹谷胱甘肽S-转移酶基因(DaGSTe1)全长cDNA序列的克隆及序列分析

从GenBank获取昆虫谷胱甘肽S-转移酶Epsilon家族基因的氨基酸序列，用MEGA5比对后找出保守区域，用Primer Premier 5.0依据保守区域设计1对简并引物GST-F1和GST-R1(表1)，用Touchdown-PCR扩增DaGSTe1基因的保守片段。反应体系20 μL:TaqMix 10 μL,模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，无菌水8 μL。Touchdown-PCR程序如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，从58 ℃到48 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，进行35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收纯化，克隆于Promega T-easy载体中，培养后送样测序(生工生物工程(上海)股份有限公司)。根据获得的cDNA片段用Primer Premier 5.0分别设计2对用于获得DaGSTe1基因3′和5′端的引物(GST3-F2、GST3-F3，GST5-R2、GST5-R3，表1)。然后根据Clontech公司RACE试剂盒说明获取DaGSTe1基因的3′和5′末端序列，将其连接到Promega T-easy 载体中，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，将测序结果用Vector NTI 11.5.1拼接出全长序列，并命名为DaGSTe1。基因的开放阅读框及翻译的氨基酸由Bioedit 7.0分析得到，翻译蛋白的分子质量和理论等电点由ExPASY软件预测。

1.4 华山松大小蠹DaGSTe1氨基酸序列多重比对、系统发育树构建及其三维结构模拟

氨基酸序列多重比较由DNAMAN 7.0完成，系统发育树采用MEGA 5构建，翻译蛋白的三维结构是由Swiss-Model在线服务器(http://swissmodel.expasy.org/workspace/)生成。

1.5 DaGSTe1基因在华山松大小蠹不同发育时期和性别的表达

用Trizol试剂盒分别提取华山松大小蠹幼虫、蛹、雌性成虫和雄性成虫的总RNA，然后反转成cDNA。以18SRNA为内参基因(扩增引物为18S-S、18S-A，表1)，采用DaGSTe1的定量PCR引物(GST-S、GST-A，表1)进行实时荧光定量PCR(Real-time quantitive PCR)，每个样品3次重复。反应体系20 μL:SYBR Premix EXTaq10 μL,模板2 μL，上、下游引物各0.8 μL，无菌水6.4 μL。反应条件为95 ℃预变性10 min；95 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸50 s，进行40个循环。采用2-ΔΔCt法[18]分析定量数据，计算DaGSTe1基因相对表达量，用Excel 2007计算并做图。

表1 试验所用引物Table 1 Primers used in the research

2 结果与分析

2.1 华山松大小蠹DaGSTe1基因全长的克隆及序列分析

根据测序结果(图1)可知，DaGSTe1基因(GenBank登录号KJ637332)cDNA全长为973 bp，包括一个654 bp的开放阅读框， 5′和3′端分别为106和213 bp的非编码区。其编码一个由218个氨基酸组成的多肽， ExPASY软件预测翻译该基因编码蛋白的分子质量约为23.567 ku，理论等电点为7.90。

2.2 华山松大小蠹DaGSTe1氨基酸序列多重比较与系统发育树的构建

经氨基酸序列多重比对及SMART程序(http://smart.embl-heidelberg.de/)搜索，发现华山松大小蠹DaGSTe1氨基酸序列在第4-77位为较保守的GST N端结构域，此结构域内含GSH结合位点，而在第86-196位为GST C端结构域，含有疏水底物结合位点；第70-77位是GST特征序列(图2)。

由图3看出，华山松大小蠹DaGSTe1与赤拟谷盗TcGSTe5、家蚕BmGSTe3、家蝇MdGSTe1、黑腹果蝇DmGSTe12、埃及伊蚊AaGSTe2和冈比亚按蚊AgGSTe2同聚在GST Epsilon类。经Bioedit 7.0计算氨基酸序列相似度得出,华山松大小蠹DaGSTe1与山松大小蠹DpGSTe1氨基酸相似度最高，为94%，与其他昆虫GST Epsilon家族氨基酸相似度高于40%。通常认为氨基酸序列相似度高于40%的GST被归为一类，因此推测DaGSTe1属于华山松大小蠹GST Epsilon家族。

图1 华山松大小蠹DaGSTe1基因全长序列Fig.1 Full-length sequence of DaGSTe1 gene of Dendroctonus armandi

2.3 华山松大小蠹DaGSTe1蛋白的三维结构模拟

Swiss-Model在线服务器生成DaGSTe1的成熟蛋白三维结构，结果(图4)表明，DaGSTe1蛋白包括1个N端结构域和1个C端结构域，其中N端结构域包括典型的4个β片层和3个α螺旋(β1α1β2α2β3β4α3)，而C端结构域包括5个α螺旋(α4α5α6α7α8)。

2.4 DaGSTe1在华山松大小蠹不同龄期和性别中的表达

由图5可以看出，DaGSTe1在幼虫和蛹中都有组成型微量表达；在雌性成虫中有低量的表达，表达量为幼虫和蛹中的2倍；而在雄性成虫中DaGSTe1高量表达，为幼虫和蛹中表达量的8倍，为雌性成虫中表达量的4倍。

3 结论与讨论

昆虫GST基因是近年来昆虫抗药性以及抗寄主外源毒素研究的热点，其中Delta和Epsilon家族的GST被大量证实是参与昆虫抗杀虫剂和寄主毒素最重要的GST类群[19-20]。

在鞘翅目昆虫中，赤拟谷盗和山松大小蠹基因组中分别有41个和28个GST基因，其中GST Epsilon基因分别有19个[21]和12个[17]，但都还没有进行相关功能分析。在研究较为成熟的双翅目和鳞翅目昆虫中，埃及伊蚊AaGSTe2和冈比亚按蚊AgGSTe2具有代谢DDT、有机磷农药和拟除虫菊酯类农药的作用[22]；黑腹果蝇DmGSTe6和DmGSTe7基因具有代谢甲基对硫磷作用,但DmGSTe3则无代谢甲基对硫磷作用[23]；家蚕GST Epsilon 家族具有过氧化酶活性和抗氧化压力的功能[24-25]。本研究通过同源克隆方法，获得1个华山松大小蠹GST Epsilon家族基因，并命名为DaGSTe1，该基因编码一个由218个氨基酸组成的多肽，这与大多数昆虫细胞质谷胱甘肽S-转移酶基因编码200～250个氨基酸多肽的结论相似。同源氨基酸比对和系统发育分析的结果都证实了华山松大小蠹DaGSTe1属于GST Epsilon家族，且与赤拟谷盗TcGSTe5同源性最高，这也与昆虫的分类地位相一致。鉴于DaGSTe1与进行了功能分析的家蚕BmGSTe3[25]有较高同源性，推测DaGSTe1有抗氧化压力和过氧化物酶的作用。

图2 华山松大小蠹DaGSTe1与其他昆虫GST Epsilon类氨基酸序列的多重比较黑色阴影表示100%相似度区域；深灰色阴影表示≥75%相似度区域；浅灰色阴影表示≥50%相似度区域；实线方框区域为DaGSTe1 N端结构域；虚线方框为DaGSTe1 C端结构域；实线下划线处为GST特征序列；虚线下划线处为GST Epsilon 特征序列。 DaGSTe1.华山松大小蠹(KJ637332)；AaGSTe2.埃及伊蚊(AAV68398)；AgGSTe2.冈比亚按蚊(2IL3)；BmGSTe3.家蚕(NP_001108466)；DmGSTe12.黑腹果蝇(AAF47266)；MdGSTe1.家蝇(3VWX)；TcGSTe5.赤拟谷盗(XP_967395)Fig.2 Multiple alignment of Dendroctonus armandi DaGSTe1 with Epsilon class GST in other insectsBlack shadow indicates 100% homology region;dark grey shadow indicates the region with more than 75% homology;light grey shadow indicates the region with more than 50% homology;solid line box region is DaGSTe1 N-terminal domain;dash line box region is DaGSTe1 C-terminal domain;the sequence underlined with solid line is the characteristic motif of GST;the sequence underlined with dash line is characteristic motif of Epsilon GST.DaGSTe1.Dendroctonus armandi (KJ637332);AaGSTe2.Aedes aegypti (AAV68398);AgGSTe2.Anopheles gambiae (2IL3);DmGSTe3.Bombyx mori (NP_001108466); DmGSTe12.Drosophila melanogaster (AAF47266);MdGSTe1.Musca domestica (3VWX); TcGSTe5.Tribolium castaneum (XP_967395)

本研究的华山松大小蠹DaGSTe1蛋白模拟三维结构与美洲牧草盲蝽(Lyguslineolaris)、棉铃虫(Heliothisarmigera)、烟草天蛾(Manducasexta)的GST Delta和Epsilon 家族蛋白三维结构类似，都包含1个N端结构域和1个C端结构域，其中N端结构域由α螺旋和β片层构成，为谷胱甘肽(GSH)的结合区域，通常这部分区域高度保守。在哺乳动物结合区域中酪氨酸负责激活谷胱巯基残基，而在昆虫中则由Delta和Epsilon家族谷胱甘肽S-转移酶中的丝氨酸承担。华山松大小蠹DaGSTe1的C端结构域全部由α螺旋构成，作为识别并结合疏水性的辅助底物，且该结构域氨基酸序列不保守[26]。

图3 构建的华山松大小蠹DaGSTe1与其他昆虫谷胱甘肽S-转移酶的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of DaGSTe1 of Dendroctonus armandi with GST from other insects

图4 华山松大小蠹DaGSTe1的三维结构Fig.4 Three dimensional structure of DaGSTe1 of Dendroctonus armandi

本研究应用实时荧光定量PCR检测DaGSTe1基因在华山松大小蠹不同发育时期的表达，结果发现DaGSTe1基因在华山松大小蠹各发育期均有表达，推测DaGSTe1基因参与幼虫、蛹和雌雄成虫体内的解毒过程，即催化谷胱甘肽与华山松萜烯类和酚类物质结合，使有毒物质被转运出胞外，从而降低寄主外源毒素对华山松大小蠹的伤害[27]。但DaGSTe1基因在雄性成虫中的高量表达，说明该基因除了具有降解外源毒素的作用外，还可能参与性别专一的华山松大小蠹信息素的转运过程。

Feng等[28]通过对云杉卷叶蛾(Choristoneurafumiferana)不同杀虫剂处理下GST基因表达的分析认为，GST不仅具有降解外源毒素的作用，而且在转运云杉卷叶蛾蜕皮激素的过程中也发挥重要作用。此外，Strode等[29]发现，冈比亚按蚊(Anophelesgambiae)GST基因在非进食期的高量表达，推测其具有调节昆虫生理方面的作用。本研究通过RT-PCR、RACE技术得到了华山松大小蠹DaGSTe1的序列全长，并通过实时荧光定量PCR技术对DaGSTe1基因在华山松大小蠹不同发育时期和性别中的表达量进行了分析，研究结果为进一步明确华山松大小蠹GST在抵抗华山松树脂毒素以及物质转运过程中的分子调控作用提供了重要价值。

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Cloning and expression of glutathione S-transferase geneDaGSTe1 ofDendroctonusarmandi

MA Jun-ning,DAI Lu-lu,ZHANG Ran-ran,CHEN Hui

(CollegeofForestry,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 The research was conducted to clone glutathione S-transferase (GST) gene inDendroctonusarmandiand analyzed its sequence features and expression at four developmental stages for demonstrating the molecular mechanism ofD.armandiGST in resisting phytotoxins and transporting hormones.【Method】 RT-PCR and RACE were employed to cloneDaGSTe1 gene and real-time PCR was utilized to examine theDaGSTe1 expression patterns at different developmental stages.【Result】 Glutathione S-transferase gene with cDNA of 973 bp was isolated fromD.armandiand named DaGSTe1 with GenBank accession number of KJ637332.It encoded a protein of 218 amino acid residues with predicted molecular weight of 23.567 ku and isoelectric point of 7.90.DaGSTe1 shared 94% identity with DpGSTe1.The protein homology demonstrated that the predicted protein structure of DaGSTe1 was similar to GST Epsilon members,with an N domain (β1α1β2α2β3β4α3) and a C domain (α4α5α6α7α8).Gene expression patterns at different developmental stages illustrated thatDaGsSTe1 was expressed at all developmental stages,but was only expressed at high quantity in male adult,which was eight times of that at larvae and pupae stages and four times of that in female adult.【Conclusion】DaGSTe1 was successfully cloned and was predicted to play a dual role in detoxification of host allele chemicals and transport of male-specific hormones.

Dendroctonusarmandi;glutathione S-transferase;gene cloning;developmental stage

2014-02-04

国家林业公益性行业科研专项(201004077)；国家自然科学基金项目(31170607)；教育部长江学者和创新团队发展计划资助项目(IRT1035)

马俊宁(1988-),男，河南三门峡人，硕士，主要从事森林昆虫研究。 E-mail:mjn404@nwuaf.edu.cn

陈 辉(1961-),男，甘肃酒泉人，教授，主要从事森林昆虫研究。 E-mail:chenhui@nwsuaf.edu.cn

时间:2015-06-30 13:47

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.08.005

Q78；S763.38

A

1671-9387(2015)08-0116-07

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150630.1347.005.html