甜荞结实性及授粉受精过程中花粉管的生长动态

张大爱，杜 莹，钱一萍，赵绪明，高金锋，王鹏科，高小丽，杨 璞，冯佰利

(西北农林科技大学/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西 杨凌 712100)

甜荞结实性及授粉受精过程中花粉管的生长动态

张大爱，杜 莹，钱一萍，赵绪明，高金锋，王鹏科，高小丽，杨 璞，冯佰利

(西北农林科技大学/旱区作物逆境生物学国家重点实验室,陕西 杨凌 712100)

【目的】 探究甜荞的结实性及授粉受精过程中花粉管的生长动态，为甜荞自交不亲和性机理的研究奠定基础。【方法】 以同型花和异型花甜荞品种为材料，在温室条件下利用自然和人工杂交授粉， 调查结实率，并对异型花品种的自交和杂交花柱进行荧光显微观察。【结果】 1)同型花品种结实率31.5%～72.7%，其为自花结实性品种；异型花品种的结实率为0～6.3%，其为自花不结实品种。2)异型花的异类型花之间杂交结实，其中以长花柱为母本杂交时的结实率高于以短花柱为母本杂交时的结实率；异型花的同类型花之间杂交时不结实或结实率很低，少量的结实发生在长花柱与长花柱类型杂交之间。3)在异型花品种中，长花柱与长花柱杂交授粉，花粉萌发，花粉管伸长，但在花柱的2/3处(时间为1～1.5 h)被抑制，其识别部位尚不清楚；短花柱与短花柱杂交授粉，花粉萌发，但花粉管没有伸长，因此其识别和抑制部位均在柱头；异类型花之间杂交花粉管发育正常，并且花粉发育速度快于同类型花之间杂交。【结论】 异型花甜荞自交或同类型花之间杂交，花粉管在柱头或花柱中被抑制使甜荞结实率降低，从而降低产量。同型花品种自交可育，结实率提高，培育同型花甜荞是提高产量的有效手段。

甜荞；自交不亲和性；结实性；花粉发育

荞麦(FagopyrumesculentumMonch.)营养丰富[1]，富含黄酮等生物活性物质[2-3]，是21世纪营养保健食品资源。荞麦有2个栽培种，分别是甜荞(FagopyrumesculentumMoench)和苦荞(FagopyrumtataricumGaerth)。甜荞有2种花型，即同型花和异型花，其中同型花雌雄蕊等长，能够自花授粉结实，常见于野生种中；异型花为雌雄蕊不等长，有2种类型，即雌蕊长于雄蕊(长花柱)和雌蕊短于雄蕊(短花柱)。

目前栽培甜荞均为异型花，群体(品种)中长花柱和短花柱的比例各约占50%。异型花自花授粉或同类型花植株之间相互授粉不结实，具有自交不亲和现象[4]，授粉结实主要是在具有不同类型花的植株之间进行的，即在长花柱花与短花柱花，或者短花柱花与长花柱花植株之间杂交，而且为虫媒花，主要依靠昆虫进行异花授粉[5-7]。甜荞的自交不亲和性及其异花授粉特性导致其结实率低，是影响甜荞产量的重要因素。由于甜荞为无限开花习性，并且难以控制授粉条件，有关甜荞结实率的研究较少且缺乏确切的数据支撑，尤其是对甜荞自交不亲和性的机制研究几乎空白。

本研究在温室无风、无昆虫的条件下，通过自然和人工杂交对甜荞的结实率进行了统计，并利用荧光显微技术观察了甜荞自花和异花授粉受精过程中花粉管的生长动态，旨在为甜荞自交不亲和性的机理研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 甜荞材料

试验于2012-2013年在西北农林科技大学E04号温室进行。试验甜荞品种包括：同型花品种12JTJ-3、12JTJ-6，均为本课题组选育；异型花品种北早生、TQ11-6、温莎甜荞，均为本课题组保存和繁殖。采用盆栽试验，且同品种同类型花的甜荞种植在同一个盆里，每盆种植3～5株。

1.2 自交、杂交方式及结实率统计

自然授粉是在温室隔离条件下自交，统计各个花柱类型的结实率。花期在各花柱类型(长花柱、短花柱、等花柱)分植株上、中、下层共标记3～5个花簇，从每个花簇第1朵花开开始，每天统计开花花朵并标记，直到最后一朵花开结束，得到每个花簇的花数，成熟期统计该花簇的结实粒数，结实粒数占开花花数的百分率即为结实率。

人工授粉分为同花授粉和异花授粉。同花授粉采用人工涂抹，花期标记花簇，每天分2次(上午、下午)用毛笔涂抹开花花朵，统计开花花朵并套袋，直到最后一朵花开结束，成熟期统计结实粒数计算出结实率。异花授粉采用人工杂交，由于甜荞具有自交不亲和现象，因此在杂交时没有去雄。选择刚开花花朵，去除同花簇上已开花朵和未开花蕾，并剪掉花簇生长顶端，取异花新鲜花粉授粉，套袋隔离，成熟期统计授粉的花数和结实粒数。

1.3 杂交花柱处理及荧光显微观察

人工授粉共6组杂交组合，即长花柱×长花柱(包括同品种和异品种)、短花柱×短花柱(包括同品种和异品种)、长花柱×短花柱(包括同品种和异品种)。分别在授粉后0.5，1，1.5，2，2.5，3 h取下花柱，放在体积分数90%乙醇与冰乙酸体积比为3∶1的混合溶液中固定1 h，然后在60 ℃的1 mol/L NaOH中清洗1～2 h。再用苯胺蓝溶液染色1 h。将雌蕊固定在载片上，滴上苯胺蓝染色液，然后轻轻盖上盖玻片，在荧光显微镜(B202，日本奥林巴斯)下观察并照相。

2 结果与分析

2.1 自然授粉条件下甜荞的结实性

自然授粉条件下不同类型甜荞的结实情况见表1。从表1可以看出，同型花品种结实率在31.5%～72.7%，而异型花品种长花柱、短花柱类型结实率在0～6.3%。因此，同型花品种为自花结实性品种，异型花品种为自花不结实品种。异型花品种中少量的结实(6.3%)在长花柱类型中。

表1 自然授粉条件下不同类型甜荞的结实率Table 1 Seed setting rate of different varieties under natural pollination condition

2.2 人工授粉条件下各类型甜荞的结实性

从表2可以看出，异型花的同类型花(无论是同品种还是异品种)之间杂交时，基本不结实或结实率很低，即同类型花之间是不亲和的，少量的结实出现在长花柱与长花柱类型的杂交之间。同型花之间、异型花的异类型花(无论是同品种还是异品种)之间以及以长花柱为母本的异型花与同型花之间杂交结实，而以短花柱为母本的异型花与同型花之间杂交结实率低或不结实。

表2 人工授粉条件下不同类型甜荞的结实率 Table 2 Seed setting rate of different varieties under artificial pollination condition

续表2 Continued table 2

注：同品种同类型花、异品种同类型花的所有杂交组合中包括同花、同株异花、异株异花授粉。

Note:Same type flowers of the same varieties and different varieties were self-pollinated and cross-pollinated by flower,flower type,plant and variety.

2.3 甜荞授粉受精过程的荧光显微观察结果

甜荞异型花品种中异类型花和同类型花杂交授粉后花粉的萌发及花粉管的发育情况见图1和图2。由图1和图2可以看出，短花柱×短花柱(无论同品种还是异品种)，从0.5 h至3 h，花粉萌发，但花粉管一直停留在柱头的位置没有伸长；长花柱×长花柱(无论同品种还是异品种)，授粉后0.5 h花粉管大致伸长到花柱1/2处，授粉后1～1.5 h大致伸长到花柱的2/3处，并且不再伸长，从2 h开始出现缩短的现象；长花柱×短花柱(无论同品种还是异品种)，授粉后0.5 h已经伸长到花柱的约2/3处，授粉后1～1.5 h已经接近珠孔，授粉后2 h已经通过珠孔进入胚囊进行受精。因此，从时间上看异类型花授粉后花粉管的伸长速度较快。

图1 甜荞异型花品种中异类型花杂交授粉后花粉的萌发及花粉管的发育从左到右依次分别表示授粉后0.5，1，1.5， 2，2.5，3 h Fig.1 Pollen germination and pollen tube development of different types of distinct mode flowers of common buckwheat after cross-pollinationThe figures from left to right show the pollens 0.5,1,1.5,2,2.5 and 3 h after pollination

图2 甜荞异型花品种中同类型花杂交授粉后花粉的萌发及花粉管的发育a、b分别为短花柱×短花柱、长花柱×长花柱；从左到右依次分别表示授粉后0.5，1，1.5， 2，2.5，3 h Fig.2 Pollen germination and pollen tube development of same types of distinct mode flowers of common buckwheat after cross-pollinationa,b stand for combinations between the short style flowers,the long style flowers of same types;The figures from left to right show the pollens 0.5,1,1.5,2,2.5 and 3 h after pollination

3 讨 论

目前栽培甜荞均为异型花品种，自花和同类型花杂交不结实或结实率很低，异花授粉受气候、昆虫等条件的影响其结实率也很低。本研究利用同型花甜荞品种为试验材料，证明其自交、杂交均能够结实，这为利用这些材料培育自花结实甜荞品种奠定了基础。

高立荣等[7]利用套袋进行自交或互交方式的研究表明，普通荞麦异类型花自花或同类型花之间杂交也有结实,而且结实均在长花柱自交或长花柱与长花柱的杂交之间。本研究利用人工杂交对同品种和异品种自花或同类型花甜荞之间杂交结实率的调查数据也进一步证明了这一观点。

唐宇等[8]研究表明，荞麦种间杂交时，以短花柱型为母本，长花柱型为父本，其杂交的亲和力较高。本研究是利用甜荞品种间的杂交进行分析，结果表明，以长花柱型为母本，其杂交的亲和力比其反交时或以短花柱型为母本杂交时的亲和力高；从花粉发育的荧光显微观察结果也可以看出，短花柱与短花柱品种杂交花粉管不伸长，长花柱与长花柱品种杂交花粉管伸长到花柱2/3处停止伸长，而长花柱与短花柱品种杂交花粉管正常生长，并且发育时间上快于以上2种杂交。这是否由于种间杂交与品种间杂交的花粉与花柱亲和力不同，还是长花柱与短花柱对外来花粉的识别、抑制等反应不同而造成的，还有待进一步研究。

孟金陵[9]对甜荞的研究证实，长花柱与长花柱品种授粉抑制部位在花柱，短花柱与短花柱品种授粉抑制部位在柱头。高立荣等[7]也认为，短花柱型授粉抑制部位在柱头，且花粉粒不萌发。本研究采用荧光显微观察了异型花甜荞中同类型花和异类型花之间杂交授粉后花粉萌发和花粉管的发育动态过程，并且确定了各自抑制的具体部位，而且也发现短花柱与短花柱杂交授粉后柱头上的花粉萌发但不伸长，证明了长花柱和短花柱2种类型授粉的抑制部位不同。

前人对许多植物的自交亲不和性生理研究认为，授粉后柱头和花柱内生理活性物质的变化是引起自交不亲和的重要因素。如对甘蓝的自交不亲和性研究表明，授粉后由于在自花授粉柱头上SOD、POD、CAT活性明显低于异花授粉柱头，并且花柱内蛋白质含量有一定的变化，因而抑制自体花粉萌发或生长[10]。相关研究表明，花粉管在柱头中生长时，柱头细胞中ATPase活性[11]、花粉管顶端Ca2+分布[12]、花粉管中核DNA[13]以及花粉管顶端的胼胝质反应[14]等均发生了变化，从而导致花粉管停止生长。至于甜荞授粉后柱头或花柱中发生了哪些生理抑制现象从而导致了自交不亲和，这还有待进一步深入研究。

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Fecundity of common buckwheat and dynamic growth of pollen tube in pollination and fertilization

ZHANG Da-ai,DU Ying,QIAN Yi-ping,ZHAO Xu-ming,GAO Jin-feng,WANG Peng-ke,GAO Xiao-li,YANG Pu,FENG Bai-li

(StateKeyLaboratoryofAridRegionCropAdversityBiologyCollegeofAgronomy,NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

【Objective】 This study investigated fecundity of common buckwheat and dynamic growth of pollen tube in pollination and fertilization to provide foundation for the study of self-incompatibility mechanism of common buckwheat.【Method】 In greenhouse,same type flowers and heteromorphic flowers were chosen to study seed-setting rates by naturally and artificially pollinating and to examine the self-pollinated and cross-pollinated styles by fluorescence microscopy.【Result】 (1) The seed setting rate of same type flower was 31.5%-72.7%,so it belonged to self-pollinated species.The heteromorphic flowers were self-incompatibilities with seed setting rate of 0-6.3%.(2) Common buckwheat species crossed with heteromorphic flowers presented higher seed setting rates with their long style flowers as the female parents than with their short style flowers as the female parents.No seeds or very low seeds occurred when own different types of flowers were cross-pollinated.(3) In different heteromorphic flower species,when different long style were cross-pollinated,their pollens germinated but their pollen tubes got inhibited at two third of the style length (1-1.5 h after pollination).Recognition and inhibition sites of the pollen tubes were still elusive. When crossed between different short style,their pollens could germinate but their pollen tubes could not elongate,so both recognition and inhibition sites were at the stigma.When the different heteromorphic flowers were cross-pollinated,their pollen tubes developed normally and pollen developed faster than that of the same type flowers formed when they were cross pollinated.【Conclusion】 When common buckwheat and heteromophic flowers were self-pollinated or their different types of flowers were cross-pollinated,their pollen tubes were inhibited at the stigma or the style,which was the main reason of decreased seed setting rate and production.When same type flowers were self fertile,the seed setting rate increased.Therefore,breeding for same type flower variety is an effective tool to improve the yield of common buckwheat.

common buckwheat;self-incompatibility;seed setting rate;pollen development

2014-02-11

陕西省科技统筹项目(2014KTZB02-03-03)；榆林市产学研合作项目(2014cxy-03-02)；西北农林科技大学唐仲英育种基金项目(A212020901)；陕西省小杂粮产业技术体系项目(K336021201)

张大爱(1987-)，女，安徽宿州人，硕士，主要从事小杂粮遗传育种及高产生态生理研究。 E-mail:1290396861@qq.com

王鹏科(1963-)，男，陕西岐山人，副教授，硕士生导师， 主要从事小杂粮遗传育种研究。

时间:2015-06-30 13:47

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.08.003

S517.032

A

1671-9387(2015)08-0103-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150630.1347.003.html