大豆根瘤菌对不同微肥及pH耐性的筛选

吴 萍，何庆元，李正鹏，史 钧，祝嫦巍

(安徽科技学院 应用微生物研究所, 安徽 凤阳 233100)

大豆根瘤菌对不同微肥及pH耐性的筛选

吴 萍，何庆元，李正鹏，史 钧，祝嫦巍

(安徽科技学院 应用微生物研究所, 安徽 凤阳 233100)

在YMA平板上对14株大豆根瘤菌进行Fe、Co、B、Mo、Zn及pH的耐性试验。结果表明，在柠檬酸铁浓度为0.05%时，64%的供试菌株能生长，当浓度增至0.25%时，所有菌株均不生长；在氯化钴浓度为0.005%时，57%的供试菌株能正常生长，当浓度增至0.025%时，所有菌株均不生长；在硼酸浓度为0.04%时64%供试菌株能正常生长，当浓度上升到0.10%时，所有菌株生长均受抑制或不生长；在钼酸钠浓度为0.4%时供试菌株均能生长，当浓度增至0.6%时，有36%的菌株能正常生长；在硫酸锌浓度为0.025%时有36%的菌株能正常生长，当浓度增至0.075%时，所有菌株受抑制或不生长。表明供试菌株对钼、硼的耐性较强，而对锌、铁、钴的耐性较弱；不同根瘤菌株对同一微量元素的耐性差异较大，同一根瘤菌对不同微量元素的耐性也有差异。多数菌株在pH6.0～8.0范围内生长正常，耐碱能力比耐酸能力强。其中AWCS13-4菌株耐受微量元素和酸碱度能力最强。

大豆根瘤菌；微量元素；耐性

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株 14株大豆根瘤菌(表1)，由安徽科技学院生物技术实验室提供。

表1 供试菌株

1.1.2 培养基 ①YMA固体斜面培养基：甘露醇10g，酵母粉1g，MgSO4·7H2O 0.2g，K2HPO40.5g，NaCl 0.1g，CaCl20.05g ，Rh微量元素液4mL，H2O 1000mL，pH 6.8～7.0(Rh微量元素液：H3BO35g，Na2MoO45g，H2O 1000mL)，琼脂15～20；②YMA液体培养基：不加琼脂的YMA培养基；③YMA固体平板培养基：与斜面培养基相同。

1.2 方法

1.2.1 菌悬液制备 将根瘤菌在无菌条件下接种于固体斜面培养基上(YMA)，于28℃培养3d。

将已活化的根瘤菌接1环到YMA液体培养基(250mL的三角烧瓶80mL培养基)中，在28℃，150r/min恒温摇床中震荡培养3d，随后用无菌的0.85%生理盐水离心洗涤3次得菌悬液备用。

1.2.2 测定方法 ①大豆根瘤菌耐铁能力的测定：分别配制不同浓度的柠檬酸铁，加入YMA固体培养基中，使其终浓度分别为0.05%、0.10%、0.25%、0.50%、0.75%、1.00%，将培养好的供试菌株菌悬液分别点种在不同浓度的柠檬酸铁的YMA平板上，每个浓度设三个重复，以不含柠檬酸铁的YMA平板为对照，于28℃培养3d，观察并记录结果；②大豆根瘤菌耐钴能力：分别配制不同浓度的氯化钴，加入YMA固体培养基中，使其终浓度分别为0.005%、0.010%、0.025%、0.050%、0.075%，接种方法同柠檬酸铁，以不含氯化钴为对照；③大豆根瘤菌耐硼能力：分别配制不同浓度的硼酸，加入YMA固体培养基中，使其终浓度分别为0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.10%，接种方法同柠檬酸铁，以不含硼酸为对照；④大豆根瘤菌耐钼能力：分别配制不同浓度的钼酸钠，加入YMA固体培养基中，使其终浓度分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%，接种方法同柠檬酸铁，以不含钼酸钠为对照；⑤大豆根瘤菌耐锌能力：分别配制不同浓度的硫酸锌，加入YMA固体培养基中，使其终浓度分别为0.005%、0.010%、0.025%、0.050%、0.075%，接种方法同柠檬酸铁，以不含硫酸锌为对照；⑥大豆根瘤菌耐酸碱能力：用HCl和NaOH将YMA固体培养基的pH值分别调至4.0、5.0、6.0、8.0、9.0、10.0，将培养好的供试菌株菌悬液分别点种在不同pH值的YMA平板上，每个浓度设三个重复，以pH 7.0的YMA平板为对照，于28℃培养3d，观察并记录结果。

1.2.3 聚类分析 将供试性状转换为数字性状, 如根据供试菌株的生长情况, 可将能生长或在平板上形成典型菌落者记为“ 1”, 否则记为“ 0”。利用NTSYSpc 2.10e软件，采用平均连锁法(UPGMA)，聚类结果以树状图谱的方式表示。

2 结果与分析

2.1 大豆根瘤菌的耐铁能力

供试根瘤菌的耐铁能力总体表现较弱(表2)，但不同菌株对铁的耐性存在一定的差异。9株供试菌株(64%)能在0.05%的柠檬酸铁YMA平板上生长，所有菌株在0.25%以上的柠檬酸铁YMA平板上不生长。其中菌株AHM6-3、AWL6-4B对铁更为敏感，低浓度的铁(0.10%)也使其生长受到抑制。而低浓度的柠檬酸铁(0.05%)对AWCS13-4有促进作用。

2.2 大豆根瘤菌的耐钴能力

供试根瘤菌的耐钴能力总体表现较弱(表2)。有8株供试菌株(57%)在0.005%氯化钴的YMA平板上能正常生长，但浓度上升到0.010%时，菌株生长均受抑制或不生长。当YMA平板上氯化钴的浓度达到0.025%时，所有供试菌株均不生长。耐钴能力相对较好的菌株是AFFZC7、ASF17、AHM7A、AWL12-1、AFL15、AHM2B。

表2 不同浓度的铁、钴对根瘤菌生长的影响

注：-不生长，+生长差，++菌落生长与对照相当，+++菌落生长比对照好。下同。

2.3 大豆根瘤菌的耐硼能力

从表3可知，供试根瘤菌的耐硼能力总体较好，但是不同菌株对硼的耐性存在一定的差异。有9株(64%)供试菌株在0.04%硼酸YMA平板上正常生长，当浓度上升到0.10% 时，所有菌株生长均受到不同程度的抑制。其中菌株AATB25对硼酸更为敏感，当浓度为0.03%时，生长均受到抑制。而低浓度的硼酸对AWCS13-4、AWL12-1、AFL15有促进作用。

2.4 大豆根瘤菌的耐钼能力

从表3可知，供试根瘤菌的耐钼能力总体表现较好。所有供试菌株均能在0.4%的钼酸钠YMA平板上生长，在0.5%钼酸钠YMA平板上有12株(86%)可以生长，5株(36%)可以在0.6%钼酸钠YMA平板上正常生长。并且低浓度钼酸钠对AWCS13-4、AWL6-4B、AHM2B菌株有促进作用，甚至浓度达到0.4～0.5%时， AWL12-1菌株生长最好。

表3 不同浓度的硼、钼对根瘤菌生长的影响

2.5 大豆根瘤菌的耐锌能力

供试根瘤菌的耐锌能力总体较弱(表4)，但是不同菌株对锌的耐性有差异。所有菌株在0.075%硫酸锌YMA平板上均受抑制或不生长，当硫酸锌浓度为0.05%时，仅有2株供试根瘤菌(14%)生长良好。在0.025%硫酸锌YMA平板上，有5株供试菌(36%)能正常生长。耐锌能力较强的菌株是AWCS13-4、AATB25、AHM2B，AHM7A对锌最敏感。但低浓度硫酸锌对AFFZC7、AWCS13-4、AFL15、AWL6-4B、AHM2B、ABL9-2有促进作用。

2.6 大豆根瘤菌的耐酸碱能力

供试根瘤菌的耐酸碱能力有一定差异(表4)，菌株在中性条件均生长良好。大部分菌株在酸性条件下生长均受影响。pH 4.0时，2株供试菌株(14%)能正常生长，36%的菌株在pH 5.0时能正常生长，pH 6.0和8.0时，93%的菌株能生长，71%的菌株在pH 9.0时能正常生长，36%的供试菌株在pH10.0时能正常生长。其中AHM6-3、AWCS13-4菌株耐酸碱能力最强，在pH4.0～10.0范围之间均可正常生长。而AATB25菌株耐酸能力最差。

表4 不同浓度的锌、pH对根瘤菌生长的影响

2.7 大豆根瘤菌对各种微量元素耐性的多样性分析

以菌株在各种微量元素的条件下能否增殖为标准，用平均连锁法(UPGMA)对来自于安徽不同地区的14株大豆根瘤菌耐性能力相似性进行聚类分析(图1)。从图1看出，安徽不同地区分离到的大豆根瘤菌对微量元素耐性能力呈现多样性，来自同一地区的大豆根瘤菌对微量元素耐性能力也呈现多样性；并且分离到的大豆根瘤菌在微量元素耐性上没有按照地理来源进行聚群，如同一类群的菌株可以来源于不同的采集点，如AWCS13-4和AATB25菌株，而同一个采集点分离到的菌株也可以聚在不同类群中，如AWL12-1和AWL6-4B菌株。以上这些现象的出现可能于当地种植制度、土地利用状况以及环境因素等多方面存在差异有关。

3 结论与讨论

供试根瘤菌对不同微量元素的耐性有差异。试验结果表明：耐钼、硼能力远高于耐钴、铁、锌的能力，耐钼能力强于耐硼能力，耐受钴、铁、锌能力上表现为锌>铁>钴。耐碱能力比耐酸能力强。其中AWCS13-4菌株耐受微量元素和酸碱度能力最强。并且不同地区大豆根瘤菌对微量元素的耐性能力呈现多样性，来自同一地区的大豆根瘤菌对微量元素的耐性能力也呈现多样性。

一定浓度的铁、钴、硼、钼、锌对根瘤菌生长有一定的促进作用。同时有研究表明微量元素还可增强根瘤菌株的竞争性和有效性。可见，一定浓度的微量元素对根瘤菌的生长、竞争结瘤和高效固氮有一定的促进作用。因此，在研究“根瘤菌+微量元素”高效复合根瘤菌剂中，微量元素不能随意复配，除需考虑根瘤菌对微量元素的耐性外，还应考虑根瘤菌的结瘤能力、竞争结瘤能力、共生固氮有效性和相应微量元素对它们的影响，同时还需注意菌剂pH。

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( 责任编辑:李孟良)

Tolerance Screening of Soybean Rhizobium in Different Microelement Fertilizer and pH

WU Ping，HE Qing-yuan，LI Zheng-peng，SHI Jun，ZHU Chang-wei

(Institute of Applied Microbiology, Anhui Science and Technology University，Fengyang 233100，China)

Tolerance experimentation of 14 rhizobial strains for five microelement (iron, cobalt, boron, molybdenum and zinc) and pH was tested using YMA plates. The results show that 64%, 57%, 64%, 100%, 36% and 36% strains could normally grow in 0.05% ferric citrate, 0.005% cobalt chloride, 0.04% boric acid, 0.40% and 0.6% sodium molybdate and 0.025% zinc sulfate, respectively. No strain was grown in 0.25% ferric citrate, 0.025% cobalt chloride, 0.10% boric acid or 0.075% zinc sulfate. The tested strains have relatively strong tolerance to molybdenum and boron and relatively weak tolerance to Zinc, iron and cobalt. The resistance of the same strain has difference among different microelements, and the resistances of the same microelement have difference among different strains. The majority of strains could normally grow in the range of pH6.0～8.0, thereinto, while AWCS13-4 have the strongest resistance for microelements and pH among all strains.

Soybean rhizobia；Microelements; Tolerance to stresses

2014-12-29

安徽省教育厅自然科学基金项目(KJ2011Z066)；安徽省教育厅自然科学基金项目 (KJ2013A077)；安徽科技学院自然科学基金项目(ZRC2013367)；安徽科技学院生物学重点建设学科项目(AKXK20102-1)。

吴萍(1958-)，女，安徽省五河县人，教授，主要从事生物肥料研究。

S565.1

A

1673-8772(2015)02-0020-05