NaCl胁迫对荆芥种子萌发及幼苗抗氧化酶活性的影响

张瑞娥，王 娟， 王智颖， 豆丽君， 刘小丽，2*

(1.阜阳师范学院 生物与食品工程学院，安徽 阜阳 236037；2.抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心，安徽 阜阳 236037)

NaCl胁迫对荆芥种子萌发及幼苗抗氧化酶活性的影响

张瑞娥1，王 娟1， 王智颖1， 豆丽君1， 刘小丽1，2*

(1.阜阳师范学院 生物与食品工程学院，安徽 阜阳 236037；2.抗衰老中草药安徽省工程技术研究中心，安徽 阜阳 236037)

用纸床培养，通过测定萌发率、胚根长、胚芽长、鲜重等生物量指标及各项生理生化指标的方法探究了不同浓度NaCl(0 mmol/L、25 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L、200 mmol/L)胁迫对特大叶荆芥幼苗种子萌发及幼苗生长的影响。结果表明：NaCl胁迫对荆芥种子萌发率无明显影响，而荆芥根长、芽长、鲜重、子叶展开数和种皮脱落数等均随浓度的增加呈下降趋势，当胁迫浓度≥100 mmol/L时抑制极为显著。SOD和POD活性在25 mmol/L的NaCl胁迫浓度下较对照组升高，而在其后的胁迫浓度下均较对照组低，阴离子氧生成量表现出相应的先下降后上升的趋势。

荆芥；NaCl胁迫；种子萌发；生理指标；抗氧化酶

长期以来, 自然因素和人为因素的影响导致土地盐渍化情况越来越严重[1]。盐碱土环境下，由于离子间的相互拮抗、离子的非滞留性和强淋溶性等原因，而致使土壤中一些植物生长所必需元素含量降低或有害物质含量增加[2]，进而改变植物细胞的结构[3]及植物的基础代谢[4-6]，在种子萌发[7]、苗期生长[8]直至整个生命周期中对植物造成很大的伤害。因此，目前不仅要关注于盐碱土壤的改良，亦要了解植物盐胁迫的生理机制，以为盐碱状态下植物的栽培奠定理论基础。

荆芥(NepetacatariaL.) 为唇形科的一年生草本植物，其干燥地上部分，是临床常用中药[9-10]。荆芥中叶大者更为鲜嫩，称为“大叶荆芥”，而特大叶荆芥(叶长6～8 cm，宽3～5 cm)的产量较大叶荆芥的产量要高出35%～85%[11]。通过研究不同浓度梯度的NaCl 胁迫对荆芥种子萌发、幼苗性状和生理指标的影响，可为筛选、鉴定和培育耐盐碱荆芥提供重要指导意义。植物整个生命周期的关键是种子萌发和幼苗生长，李秀霞、张吉立、 张锦伟、于泉林等人及国家标准中都采用种子萌发和幼苗生长状况作为评价盐害对植物的影响程度的指标[12-16]。前人通过盐胁迫对紫苏、海滨锦葵、决明等类似荆芥的药用植物的种子萌发和幼苗生长等方面进行了研究[17-19]。但是针对特大叶荆芥种子，NaCl胁迫对其的影响的研究还鲜见报道。基于此，本试验主要以特大叶荆芥种子为试验材料，对其进行一定时间的NaCl胁迫处理和缓解生长，探究NaCl胁迫对特大叶荆芥种子萌发、幼苗生长及生理生化指标的影响，以期为解决盐胁迫对荆芥的危害及荆芥耐盐性鉴定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试材料

供试品种为特大叶荆芥种子，购于阜阳市颍汇大市场。

1.1.2 试剂配制

蒸馏水；NaCl母液；Hangland完全培养液；0.05 mol/L磷酸缓冲液(PH7.8)；SOD反应液[130 mmol/L甲硫氨酸溶液、750 μmol/L氮蓝四唑溶液、100 μmol/LEDTA-Na2溶液]；20 μmol/L核黄素溶液；20 mmol/L KH2PO4；POD反应混合液[取100 mmol/L PH6.0 PBS 50 mL，加入愈创木酚28 μL，加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30% H2O219 μL,混合均匀，保存于冰箱中]；1 mmol/L盐酸羟胺(70 mg/L)；磺胺；萘胺。

1.2 试验方法

1.2.1 种子处理

荆芥种子用0.1% KMnO4浸泡消毒15分钟，用蒸馏水冲洗干净，并将漂浮于水面上的死种子挑出，重复至溶液无色。

1.2.2 种子萌发试验

准备18套干燥而洁净的直径为9 cm的培养皿，平均分成三组即3个重复，对每组培养皿对应NaCl浓度(0、25、50、100、150、200 mmol/L)进行编号(NCK、NT1、NT2、NT3、NT4、NT5)并贴标签，每培养皿垫2张定性滤纸后加入对应浓度的NaCl溶液20 mL，从消毒过的荆芥种子中精选大小一致、健壮饱满的籽粒，分别取100 粒种子摆放入垫有2 层滤纸的培养皿中，尽量保持籽粒间间距一致，避免垛叠影响结果，摆放完成后，将培养皿置于恒温培养箱中，25 ℃无光照培养。每天需定时定量更换滤纸及处理液(前5天为20 mL，后几天为10 mL)，观察种子萌发情况并记录发芽粒数。

1.2.3 缓解生长试验

待NaCl各浓度中均再无种子萌发后，更换滤纸，并将处理液更换为Hoagland 营养液每皿5 mL，将材料移入智能光照培养箱中培养，白天12 h、25 ℃、六级光照；晚上12 h、23 ℃、无光照，每天根据干湿度情况对材料适量添加Hoagland完全培养液，使植物体正常生长，并于两周后观察记录荆芥成苗数。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 生物量指标的测定

NaCl胁迫处理前8天每天观察并记录每培养皿中的种子萌发数，计算萌发率；于第9天观察记录子叶展开数和种皮脱落数；第10天，每皿随机选取10株荆芥植株，测其根长、芽长，用滤纸吸干植株表面水分后测量鲜重；计算缓解生长后的成苗率。

1.3.2 抗氧化酶活性的测定

1.3.2.1 酶液的提取

每一处理组中分别称量完整的荆芥植株0.3 g放入预冷的研钵中，加1 mL预冷的0.05 mol/L磷酸缓冲液(PH7.8)研磨，待研磨成匀浆后再加1 mL磷酸缓冲液(PH7.8)继续研磨，之后将其转移到10 mL离心管中，先后加2 mL磷酸缓冲液到研钵中洗涤两次，再转移到离心管。将离心管放入离心机中，所得匀浆用LD-4A低速离心机于4 000 r/min下离心10 min,将上清液小心倒入干净的离心管，即为提取的酶液。

1.3.2.2 酶活性及阴离子氧生成量的测定

SOD( 超氧化物歧化酶) 活性的测定采用王学奎的NBT(氮蓝四唑)法[20]；POD (过氧化物酶)活性的测定阴离子氧生成量的测定均采用瞿伟菁、张志良的方法[21]：分别是愈创木酚比色法和羟胺法。

1.4 数据处理

试验数据的记录和计算用Microsoft Excel 2003；数据的处理和统计分析用SPSS 软件(13.0 版本)完成。

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫对荆芥种子萌发和幼苗性状的影响

2.1.1 NaCl胁迫对萌发率、子叶展开和种皮脱落的影响

根据种子在盐胁迫下的萌发率和幼苗生长指标可以评价萌发期的耐盐性。由表1可以看出，在胁迫处理一天后的萌发率随着胁迫浓度的升高而降低，低浓度(25～50 mmol/L)NaCl胁迫对一天后的萌发率影响较小，分别比对照组下降了2.65%和1.78%，未达到显著程度。NaCl在100 mmol/L、150 mmol/L和200 mmol/L的胁迫浓度下，分别比对照组下降了39.82%、66.37%、88.51%，差异显著(P<0.05)。在第二天到第八天，各处理组的萌发率相近，无明显变化，并与对照组的萌发率差异不显著。说明在这期间盐胁迫对荆芥种子的萌发并无明显影响，进一步说明荆芥种子萌发期的耐盐性高，不易受到盐碱地的迫害。

在不同浓度NaCl溶液胁迫下，处理组的子叶展开数及种皮脱落数均低于对照组，分别比对照组减少13.89%、30.56%、96.29%、100%、100%和10.65%、20.78%、96.29%、100%、100%，随着胁迫浓度的增大而减少，且差异显著(P<0.05),以致最后两组的子叶展开数和种皮脱落数均为0。说明盐胁迫对荆芥幼苗的生长存在着明显的抑制作用，即使得荆芥幼苗发育缓慢，浓度越大，生长越缓慢，胁迫浓度在100 mmol/L及之后荆芥停留在种胚阶段而无幼苗生长。

表1 NaCl胁迫下荆芥种子萌发及幼苗生长指标的影响

注：表中数值为三次重复的平均值±标准误差，字母表示相同天数不同NaCl浓度下萌发率、子叶展开率及种皮脱落百分数在P<0.05水平上的显著性差异。

2.1.2 NaCl胁迫对根长、芽长、鲜重的影响

从图1可以看出，根长和芽长均比对照组中的数值小(根长：2.063 cm、2.008 cm、0.582 cm、0.112 cm、0.117 cm、0.093 cm；芽长：2.108 cm、1.923 cm、0.957 cm、0、0、0)，且基本随着NaCl浓度的升高而下降，根长及芽长分别比对照组下降2.67%、71.79%、94.57%、94.33%、95.49%和8.78%、54.6%、100%、100%、100%，在第3个胁迫浓度(100 mmol/L)已没有芽的的形成，且第3个浓度之后根长的降低趋于平稳，说明低浓度的NaCl(<100 mmol/L)萌发的种子，盐胁迫下具有根和芽的生长，高浓度的NaCl(≥100 mmol/L)溶液中的种子，虽能够萌发(以突破种皮为标准)，但在盐溶液中很难有芽的的形成，说明盐胁迫对根和芽的生长存在明显的抑制作用，且对芽的抑制较强。

由图2可以看出，处理组的荆芥植株鲜重均比对照组小(0.016 14 g、0.015 17 g、0.008 69 g、0.006 16 g、0.005 98 g、0.006 41 g)，基本随着胁迫浓度的增加株重逐渐下降，分别比对照组下降6.01%、46.16%、58.49%、62.95%、60.29%，说明盐胁迫对生长物质的积累存在抑制作用，即盐胁迫使得生长缓慢，有机物质积累减少，不利生长。

图1 NaCl胁迫对根长和芽长的影响

图2 NaCl胁迫对荆芥鲜重的影响

2.1.3 NaCl胁迫对荆芥成苗率的影响

盐胁迫对荆芥植物体的伤害程度可以通过成苗率(73.95%、70.26%、66%、6.2%、0.94%、0.43%)直观的表现出来。由图3可见，处理组的成苗率均低于对照组，分别是较对照组下降了4.99%、10.75%、91.62%、98.73%、99.42%，随着胁迫浓度的增高成苗率不断下降。说明NaCl抑制幼苗的生长，使得荆芥生长停滞或死亡。其次，可以看出，在100 mmol/L、150 mmol/L和200 mmol/L的胁迫浓度下，荆芥成苗率逐渐降低，并显著(P<0.05)低于25 mmol/L和50 mmol/L胁迫浓度下的成苗率，说明从100 mmol/L开始，盐胁迫的危害达到极大，到200 mmol/L时，3个重复组中的300粒种子中只一株幼苗，其它植株或只萌发不成苗，或不萌发。

2.2 NaCl胁迫对荆芥植物体生理指标的影响

2.2.1 NaCl胁迫对SOD活性的影响

图4显示了荆芥在不同NaCl浓度胁迫下SOD活性基本变化趋势(455.88、463.46、345.58、285.13、245.71、163.39 U/g)。与对照组相比，低浓度NaCl(25 mmol/L)胁迫下，SOD活性较高，较对照组高出1.64%，即胁迫环境下导致植株产生SOD,以清除不良环境致使植株产生的过多的活性氧自由基。胁迫浓度在25 mmol/L以上的处理组SOD活性均比对照组小，分别较对照组下降24.19%、37.46%、46.1%、64.16%，且与对照组相比均是差异显著(P<0.05)。另外，随着胁迫浓度的升高，SOD活性逐渐降低，即SOD活性随NaCl浓度的增高呈现先升后降的变化趋势，说明高浓度的NaCl抑制植株生长，过多的活性氧自由基积累抑制了SOD的活性。

图3 NaCl胁迫对荆芥植物体成苗率的影响

图4 NaCl胁迫对SOD活性的影响

2.2.2 NaCl胁迫对POD活性的影响

图5 NaCl胁迫对POD活性的影响

图6 NaCl胁迫对阴离子氧生成量的影响

2.2.3 NaCl胁迫对阴离子生成量的影响

图6显示NaCl胁迫下阴离子氧生成量变化趋势(8.704 9、3.442 8、9.295 5、17.669 1、25.624 8、30.249 4 nmol/g·min)。在不同浓度梯度的NaCl胁迫下，阴离子氧生成量呈现先降后升的变化趋势。在25 mmol/L的NaCl胁迫下，阴离子氧生成量较对照组低60.45%，说明荆芥植株对胁迫的响应使得体内产生清除阴离子氧的酶活性增强。在50 mmol/L及之后的浓度胁迫下，其阴离子氧生成量分别是对照组的1.07倍、2.03倍、2.94倍、3.47倍。100 mmol/L、150 mmol/L、200 mmol/L的NaCl胁迫下，阴离子氧生成量与对照组相比均为差异显著(P<0.05)。说明高浓度的NaCl胁迫严重影响荆芥植物体的代谢，导致清除阴离子氧的活性酶减少，阴离子氧含量上升，危害植物体的生长。

3 总结

种子萌发率作为衡量种子活力的指标之一，可以反映出荆芥种子耐盐性的高低。通过对荆芥种子萌发实验的数据分析，可以看出NaCl胁迫对种子的萌发并无明显影响。该结果与王桔红和陈文对黑锅枸杞的研究[22]中种子萌发对NaCl胁迫非常敏感的结论不一致。这可能是由于荆芥种子外包裹的白色粘膜对种子的保护作用，使得种子免于不良环境的影响，提高了种子萌发时期的耐盐性，使种子不易受到盐碱地的伤害，因此，处理组的萌发率与对照组差异不显著。

对于已萌发的荆芥种子而言，NaCl胁迫对其胚根、胚芽及鲜重等各种生物量指标均有不同程度的影响。研究表明，对芽的抑制能力强于对根的抑制能力，并随着浓度的升高，其影响越来越显著，当胁迫浓度大于50 mmol/L时尤为显著，在之后浓度胁迫中，已无胚芽出现。同时，鲜重也随着胁迫浓度的升高而降低。这与乔绍俊等对紫苏的研究[17]结果一致。可能是NaCl胁迫导致荆芥组织细胞出现生理性缺水，也可能是高浓度的盐胁迫导致质膜选择透过性降低而使得Na+和Cl-在细胞内大量积累，导致代谢紊乱[23]。

大量研究表明, 植物抗性与其体内保护酶系统对活性氧的清除能力直接相关[24]。研究结果表明，NaCl胁迫下，荆芥植株的SOD、POD等抗氧化酶活性都发生了明显的变化。都在25 mmol/L胁迫时较对照组出现相应的升高，而在之后较对照组出现逐步降低的趋势。这说明受低浓度NaCl胁迫的荆芥植株SOD、POD能够协同作用，使活性氧的量维持在一个低水平上，降低阴离子氧对植株的伤害，也即降低NaCl胁迫对植株的伤害，而随着胁迫浓度增高，则影响到荆芥自身物质的合成，导致SOD和POD活性降低，这与李影丽等对舟山新木姜的研究[25]结果相似。因此，阴离子氧的生成量也出现相应(先降后升)的变化趋势。

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Effect of NaCl stress on germination and seedling′s antioxidant enzymes activity of Nepeta cataria L.

ZHANG Rui-e1，WANG Juan1，WANG Zhi-ying1，DOU Li-jun1，LIU Xiao-li1，2*

(1.SchoolofBiologyandFoodEngineering,FuyangNormalUniversity,FuyangAnhui236037,China；2.EngineeringTechnologyResearchCenterofAnti-agingChineseHerbalMedicine,FuyangAnhui236037,China)

By the method of filter paper cultivation, some biomass indexes including germination rate, radical length, germ length, fresh weight and some physiological indexes were studied to explore the influence of NaCl(0 mmol/L, and 25 mmol/L, and 50 mmol/L, and 100 mmol/L, and 150 mmol/L, and 200 mmol/L) stress on seed germination and seedling growth of Nepeta cataria L..The results showed that effects on seed germination rate was not significant under NaCl(0 mmol/L, and 25 mmol/L, and 50 mmol/L, and 100 mmol/L, and 150 mmol/L, and 200 mmol/L) stress,while these indexes including root length, bud length, fresh weight, the number of cotyledons opened and seed coat drop decreased with the increasing of NaCl concentration, when the concentrations is higher than 100 mmol/L the inhibition was significant. When concentration of NaCl was 25 mmol/L, SOD and POD activity was higher than the control group, while under subsequent stress, concentration activity was lower than the control group, and the anionic oxygen generation showed a corresponding upward trend after the first drop.

NepetacatariaL.; NaCl stress; germination abilities; physiological index; antioxidant enzymes

2015-02-28

安徽省教育厅自然科学一般项目(KJ2013B200)；阜阳师范学院自然科学重点项目(2015FSKJ03ZD)；阜阳师范学院自然科学一般项目(2012FSKJ03，2013FSKJ18)资助。

张瑞娥(1976-)，女，硕士，讲师，研究方向：植物营养与逆境生理。

刘小丽(1967-)，女，博士，副教授，研究方向：药用植物学，Email:Liu-x-l2002@sina.com。

Q945.78

A

1004-4329(2015)03-059-06

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329(2015)03-059-06