莱菔硫烷对H446细胞株的抑制作用及CYR61的影响*

杨国俊，李 宁，王保伟，李宜培，李 艳

(1.河南医学高等专科学校，郑州 451191； 2.河南农业大学，郑州 450000)

基础医学

莱菔硫烷对H446细胞株的抑制作用及CYR61的影响*

杨国俊1，李 宁2，王保伟1，李宜培1，李 艳1

(1.河南医学高等专科学校，郑州 451191； 2.河南农业大学，郑州 450000)

目的 探讨莱菔硫烷(sulforaphane, SFN)对小细胞肺癌H446细胞株的抑制作用及CYR61基因表达的影响。方法 MTT法检测SFN对H446细胞的抑制作用；流式细胞仪检测细胞凋亡情况；Real-time PCR检测H446肺癌细胞株CYR61表达。结果 MTT结果显示：SFN从20 μM的浓度起开始出现细胞抑制效应，抑制率与SFN浓度呈正相关关系。40 μM SFN干预组的CYR61基因表达量较高，与其他组之间差异有统计学意义。结论 SFN在一定浓度下对H446细胞株有抑制作用，并促进CYR61基因表达，为食用十字花科类蔬菜防治肺癌提供依据。

莱菔硫烷；H446；CYR61；Real-time PCR

随着肺癌发病率和死亡率的逐年上升，已成为影响中国居民健康的主要恶性肿瘤之一[1]。肺癌中约有20%为小细胞癌，其恶性程度高，倍增时间短，转移早而广泛，极易发生继发性耐药，容易复发。研究证实莱菔硫烷(sulforaphane, SFN)可抑制A549细胞株的增殖，增加肿瘤组织中CYR61基因的表达[2]。目前，研究者对SFN抑制小细胞肺癌的作用研究较少。该研究通过MTT、流式细胞仪和real-time PCR等方法分析探讨了SFN对H446细胞株的抑制作用、细胞凋亡及CYR61表达的影响，从而为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 SFN来源于中国农业科学院，纯度为95%；H446肺癌细胞株购于中国科学院；1640培养基(Sigma 公司)；10%胎牛血清；培养条件(37℃，5%CO2，饱和湿度)。

1.2 仪器及试剂 MTT 裂解液(Sigma公司)；RPMI 1640培养粉(Gibco公司)；A-5082型酶标仪(Tecan公司)；荧光定量PCR仪(Genetimes Technology,Inc.)；CYR61和β-actin 引物(Sangon)；流式细胞仪(BD公司)。

1.3 MTT实验

1.3.1 分组 SFN无水乙醇稀释，加入细胞培养液中，分为0、5、10、20、40、80、160 μM SFN 7个浓度组。

1.3.2 MTT 细胞悬液200μl加入96孔培养板中培养。 24 h后，加入0、5、10、20、40、80、160 μM SFN不同浓度培养液200 μl，每一剂量6孔。培养8、16、24、32 h后，各孔分别加入5 g·L-1的MTT 20 μl，作用4 h，吸弃MTT。每孔加入二甲基亚砜150 μl，振荡10 min后用490 nm 波长在酶标仪上检测吸光值。将MTT的50%抑制率作为确定SFN作用时间和浓度的依据。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡 吸去各组上清液，常规消化细胞；1 500 r·min-1离心5 min，弃上清；PBS重悬细胞后，移至EP管中，1 500 r·min-1离心5 min。加5μl的Annexin V-FTTC溶液和2.5μl的PI至100 μl细胞混悬液中，混合后室温避光反应30 min，加入反应缓冲液400 μl，流式细胞仪检测。

1.5 CYR61基因表达的检测

1.5.1 CYR61和β-actin引物设计 CYR61和β-actin特异引物的设计采用PRIMER3软件，由上海Sangon合成。见表1。

表1 β-actin和CYR61基因的引物

1.5.2 RNA提取及逆转录 RNA提取采用TRIzol试剂，cDNA合成采用AMV逆转录试剂盒。

1.5.3 Real-time PCR 建立15 μl反应体系：10×buffer 1.5 μl，dNTPs(2.5 mM)1.5 μl，MgCl2(20 μM)1.0 μl，Fluorescein(1000×)0.09 μl，Eva Green(20×)0.75 μl，正反引物 (3 mM)各0.6 μl，Tap (2.5 u/μl) 0.15 μl，模板DNA 0.5 μl，水8.91 μl。β-actin和CYR61扩增条件：94℃ 3 min，94℃ 20 sec，58℃ 20 sec，72℃延伸40 sec，89℃ 15 sec采集荧光，40个循环。

1.6 统计方法 采用SPSS 18.0软件对试验结果进行方差分析，以α=0.05作为检验水准。

2 结果

2.1 MTT检测结果 SFN在10、20、40、80、160 μM范围，干预 8、16、24、32 h后，在20 μM/16 h处开始出现抑制效应，存在明显的剂量效应关系和时间效应关系。干预32 h的50%抑制率对应的SFN浓度为71 μM，故将32 h作为细胞干预时间较为合适，SFN浓度分别设为：0、20、40、80 μM。

2.2 SFN对H446细胞凋亡的影响 SFN作用于H446细胞后，凋亡率随SFN浓度的增高而升高，呈明显的剂量依赖性。见表2。

单因素方差分析组间比较结果显示， 各组间差异均有统计学意义(P<0.01)。

2.3 SFN干预后Cyr 61基因的Real-time PCR结果 单因素方差分析两两比较结果显示， 40 μM浓度SFN干预组的CYR61表达量较高，与其他组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表2 不同浓度SFN对H446细胞凋亡率的影响%]

表3 H446细胞株CYR61的Real-time PCR Ct 值

注：与其他组比较，1)P<0.05。

3 讨论

莱菔硫烷是从十字花科蔬菜中提取的一种异硫氰酸盐。许多研究证实，莱菔硫烷具有很强的化学防癌和抗癌活性，对乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、肺癌、胃癌、结肠癌和白血病等多种癌症具有抗癌活性[3-6]，有望成为一种极有前景的抗癌药物[7-8]。作用机制可能是抑制一相代谢酶的活性、诱导二相代谢酶的活性，导致细胞周期阻滞及细胞凋亡发挥抗癌作用[9-10]；影响肿瘤细胞的增殖及生长周期，侵袭、并能抑制血管生成[11]等。目前，临床上对小细胞肺癌的治疗虽然以化疗为主，但疗效并不理想，且毒副作用大，因此，该实验设计时未使用阳性对照药物。研究结果显示：SFN对H446细胞株有明显的抑制作用，且具有剂量效应关系和时间效应关系特点，SFN浓度越大，干预时间越长，抑制率越大；H446细胞凋亡率与SFN呈明显的剂量依赖性。

多数研究结果显示，CYR61基因对不同组织的肿瘤发展起不同的调控作用。CYR61在乳腺癌、横纹肌肉瘤、结肠腺癌、卵巢癌等癌组织中高度表达[12]；在非小细胞肺癌、前列腺癌、肝癌等组织中低度表达[13]。该研究中，定量Real-PCR结果显示，SFN干预32 h后40 μM SFN浓度组的CYR61基因表达量显著高于其他组。80 μM SFN浓度组的CYR61基因表达量降低可能与干预浓度过高导致活细胞数量减少有关。SFN可能是小细胞肺癌的潜在治疗药物，其机制可能是通过增加CYR61基因的表达而实现，具体机制还需深入研究。

综上所述，SFN可抑制肺癌细胞株的生长，可能是治疗肺癌的一个潜在药物，且其提取于天然十字花科植物，毒副作用小。因此，加强对十字花科植物中莱菔硫烷功能的研究，以十字花科植物为原料研制具有抗癌作用的食源性药物，具有重要的意义。

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[责任编校：杨红梅]

Inhibition of Sulforaphane on H446 Cell Lines and its Effect on CYR61 Expression

YANG Guo-jun1， LI Ning2， WANG Bao-wei1， LI Yi-pei， LI Yan1

(1.HenanMedicalCollege,Zhengzhou451191； 2.HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450000,China)

Objective To explore the inhibition of SFN on H446 cell lines and its effects on CYR61 expression. Methods The inhibition of SFN on H446 cell lines was detected by MTT. The cell apoptosis was detected by flow cytometry. CYR61 expression level in H446 lung cancer cell lines was identified by real-time PCR. Results MTT results indicated that SFN had a restrain effect with a dose-dependent manner when the concentration exceeded 20 μM. The expression of CYR61 was higher in the SFN intervention group of 40 μM and its difference compared with other groups has statistical significance.Conclusion SFN inhibited the growth of H446 cells in a concentration-depended manner and promoted CYR61 expression of H446 lung cancer cell lines, which provides basis for vegetable-broccoli in the prevention of lung cancer.

sulforaphane; H446; CYR61; Real-time PCR

2014-11-10

杨国俊(1968-)，男，河南省周口市人，硕士，副教授，从事营养与疾病的研究。

河南省重点科技攻关计划项目(编号：142102310089)。

R 730.1

A

1008-9276(2015)04-0413-03