采用荧光猝灭法研究穗花杉双黄酮与牛血清白蛋白的相互作用

陈科力，赵 平

(湖北中医药大学 教育部中药资源和中药复方重点实验室，武汉 430065)

采用荧光猝灭法研究穗花杉双黄酮与牛血清白蛋白的相互作用

陈科力，赵 平

(湖北中医药大学 教育部中药资源和中药复方重点实验室，武汉 430065)

目的:运用荧光猝灭法研究不同温度下穗花杉双黄酮(AMF)与牛血清白蛋白 (BSA)的相互作用. 方法:采用荧光光谱研究AMF与BSA之间的猝灭类型，计算二者之间的结合常数及结合位点数等. 结果:穗花衫双黄酮能使BSA发生内源性荧光猝灭，属静态猝灭机制.在298,308,318 K下,AMF与BSA结合常数分别为6.73, 6.38, 6.17 L·mol-1, 结合位点数n近似为1; 热力学分析表明AMF与BSA之间结合力为静电力作用; 同步荧光光谱表明AMF使BSA构象发生改变，且色氨酸所处微环境的疏水性增强. 结论: 荧光猝灭法可用于AMF与BSA之间结合反应的研究，方法简便，灵敏度高.

穗花杉双黄酮；牛血清白蛋白；荧光猝灭

血清蛋白是血清中含量最丰富的蛋白质，它能与许多内源及外源性化合物结合，起到存储和转运作用，是药物发挥药效的重要载体和靶分子. 药物在体内的吸收分布、代谢及排泄等过程，直接影响到药物在其作用部位的浓度和有效浓度的持续时间，从而决定药物药理作用和毒性作用的发生、发展和消除. 而影响药物在体内分布的因素很多，其中药物与血清白蛋白的结合率是决定药物在体内分布的重要因素，因此，研究药物与血清蛋白相互作用在药理学、药效学、生物化学等方面都有重要作用[1].

穗花杉双黄酮(AMF)是中药卷柏的主要活性成分之一，它是一种双黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤[2]、降血糖和扩张血管等多种生物活性,目前对其与血清白蛋白相互作用的的研究尚不多见[3，4].

荧光光谱法因其仪器常见、方法简单、操作方便、灵敏度高且样品用量小等优点，而成为研究生物大分子特别是蛋白质与各种小分子相互作用的重要手段[5-10]. 本实验采用荧光猝灭法研究了AMF与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用，得到了二者之间反应的猝灭常数、结合常数、结合位点数等，根据热力学参数探讨了它们之间的作用力类型，为进一步阐明在AMF人体内的储存方式、传输机制及药理作用等提供了重要信息.

1 仪器与试剂

F-4600型荧光分光光度计(日本日立公司),HB-1000 型杂交炉(基因有限公司).

磷酸盐缓冲液(PBS,上海捷瑞生物工程有限公司), BSA(上海捷瑞生物工程有限公司)用水配置成浓度为2.00×10-5mol·L-1的溶液, AMF(中国食品药品检定研究所)用乙醇配置成浓度为5.00×10-5mol·L-1的溶液, 实验用水为二次蒸馏水, 乙醇等其他试剂均为分析纯, 上述溶液均置于1～4 ℃冰箱中保存.

2 试验方法

在8支试管中分别加入1.0 mL的PBS缓冲溶液，200 μL BSA溶液，再分别加入0，20，30，40，50，60，70 μL的浓度为5.00×10-5mol·L-1穗花杉双黄酮溶液，然后分别用水稀释至2.0 mL，混合均匀后，在一定温度下恒温反应30 min.以激发波长为280 nm，激发和发射狭缝为5 nm条件下，扫描300～450 nm范围内的荧光发射光谱.

3 结果与讨论

3.1 AMF对BSA的荧光猝灭光谱

固定BSA的量，改变AMF在体系中的浓度，图1是不同浓度的AMF存在条件下体系的荧光发射光谱，如图所示，BSA在338 nm处有最大吸收峰，随着AMF浓度的增加，BSA荧光逐渐被猝灭，表明AMF与BSA发生较强的相互作用.

(a) 2.00×10-6L mol·L-1 BSA； (b) to (g): 2.00×10-6L mol·L-1 BSA in the presence of 5.00×10-7,7.50×10-7,1.00×10-6,1.25×10-6,1.50×10-6,1.75×10-6 mol·L-1 AMF, respectively图1 荧光发射光谱图Fig.1 Fluorescence emission spectra

引起蛋白荧光猝灭的原因有动态和静态猝灭两种.动态猝灭是一种电子或能量转移过程，是猝灭剂与荧光物质在激发态的相互作用，其扩散系数与双分子猝灭常数随温度的升高而增大.静态猝灭过程一般在基态生成不发荧光的复合物，且复合物的稳定性与静态猝灭常数随温度的增加而减小[11]. 动态猝灭过程符合Stern-Volmer方程[12]：

F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q].

(1)

F0,F分别为加入BSA前后的荧光强度，Ksv为猝灭速率常数，Kq为双分子猝灭反应速率常数，τ0为猝灭剂不存在时生物大分子的平均寿命，约为10-8s[13],[Q]为猝灭剂AMF.先假定该反应过程为动态猝灭，根据Stern-Volmer方程，F0/F与药物的浓度[Q]呈线性关系，由F0/F对[Q]作图,所得直线的斜率即为Ksv(如图2).

分别测定298,308,318 K条件下的AMF对BSA的荧光猝灭影响，结果表明猝灭常数随着温度的增加而减小(见表1)，且求得的猝灭速率常数Kq远大于各类猝灭剂对生物大分子的最大猝灭常数2.00×1010L·moL-1·s-1,不符合动态猝灭规律，由此可推断，AMF对BSA的猝灭过程属于静态猝灭.

图2 不同温度下穗花衫双黄酮对BSA荧光猝灭的Stern-Volmer 曲线Fig.2 Stern-Volmer of fluorescence of BSA quenching by AMF at different temperatures(λex=280 nm, λem=338nm,pH=7.4 )

T/KKsv/(L·mol-1)Kq/(L·mol-1)R2988.9×1058.1×10130.98843088.1×1058.9×10130.99373187.2×1058.1×10130.9952

3.2 结合常数、结合位点的确定

对于静态猝灭，结合常数、荧光强度与猝灭剂浓度之间的关系可用下式[14]表示:

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlg[Q].

利用lg[(F0-F)/F]对lg[Q]作图可得线性关系，如图3所示，根据线性拟合的斜率和截距可算出结合常数KA和结合位点数n(见表2).从表2可以看出AMF与BSA的结合常数较大,随温度升高而降低,即所形成的复合物稳定性降低[15],但温度对结合位点数n的影响较小,n约为1.

图3 BSA与AMF相互作用位点结合模型图Fig.3 The binding sites number of BSA-AMF at 298, 308,318 K, respectively

T/KKA(L·mol-1)nR2986.731.130.97033086.381.080.99483186.171.050.9932

3.3 AMF与BSA之间作用力类型的确定

有机小分子与生物大分子之间的结合作用力包括氢键作用、范德华力、静电作用、疏水作用力[16].当温度变化不大时反应的焓变ΔH可以看作一个常数.根据公式Van′t Hoff方程[17]：

lnK=ΔS/R-ΔH/TR.

其中K为猝灭常数，T为温度(298,308,318 K),以lnK对1000/T作图得到直线(如图4)，通过直线截距和斜率求得ΔS和ΔH(见表3). 不同温度下吉布斯自由能ΔG由下式计算：

ΔG=ΔH-TΔS.

图4 Van′t Hoff 曲线Fig.4 Van′t Hoff plot

根据反应前后热力学焓变ΔH、熵变ΔS的相对大小可判断药物与蛋白质之间的主要作用力类型[18]. 从表3可以看出ΔG<0,说明反应是自发进行的；ΔH<0，ΔS>0,根据Ross和Subramanian[18]两位学者判断小分子与生物大分子作用力类型的规律，AMF与BSA形成复合物的作用力主要为静电力.

表3 AMF与BSA相互作用的热力学参数

3.4 AMF对BSA构象的影响

同步荧光光谱可以反映药物分子对蛋白质构象变化的影响.由Δλ=15 nm和Δλ=60 nm所得同步荧光光谱分别显示酪氨酸(Tyr)残基和色氨酸(Trp)残基的光谱特征[19-21]. 因芳香氨酸残基的最大发射波长与其所处环境的极性有关，根据最大荧光发射波长的变化可判断残基所处微环境的变化[22]. 如图5中(a)、(b)分别为Δλ=15 nm和Δλ=60 nm时AMF与BSA作用的同步荧光光谱. 图中显示，在BSA浓度一定时，随着AMF浓度的增加，BSA的荧光强度被猝灭，酪氨酸的最大发射峰基本保持不变，而色氨酸的最大发射峰略微蓝移，表明AMF的加入使BSA的构象发生改变[23]. 在反应过程中酪氨酸残基所处微环境基本没有变化，而色氨酸所处微环境的疏水性增强，亲水性下降，表明AMF与BSA的结合位点更接近色氨酸残基.

CBSA=2.00×10-6 mol·L-1 , from 1 to 9 the CAMF : 0, 0.25×10-6, 0.50×10-6, 0.75×10-6, 1.00×10-6, 1.25×10-6, 1.50×10-6, 1.75×10-6, 2.00×10-6mol·L-1 respectively. (a) Δλ=15 nm, (b) Δλ=60 nm图5 AMF与BSA作用的同步荧光光谱图Fig.5 The synchronous fluorescence spectra of BSA in the present of AMF (T=298 K, pH=7.4)

4 结论

经实验及理论计算表明，AMF对BSA的荧光猝灭机理为静态猝灭，与BSA相互作用时具有一个结合位点，且它们反应为自发过程.由于二者的结合常数较大，易与白蛋白结合形成复合物，因此能够明显影响AMF在血浆内的游离药物浓度，从而影响其在体内的转运过程及药物代谢、药理作用等，因此研究AMF与白蛋白的相互作用对指导临床用药具有重要意义.

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Study on the Interaction between Amentoflavone and Bovine Serum Albumin by Fluorescence Quenching Method

ChenKeli,ZhaoPing

(Key Laboratory of Education Department on Traditional Chinese Medicine Resource and Compound Prescription, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China)

Objective: To study the mechanism of interaction between Amentoflavone (AMF) and Bovine Serum Albumin (BSA) at different temperatures by fluorescence quenching method. Method: The quenching type, binding constant and binding site was investigated by fluorescence spectrometry. Result: AMF could induce an endogenous fluorescence quenching of BSA under a mechanism of static quenching. The binding constants were detected to be 6.73(298 K), 6.38(308 K), 6.17(318 K) L·mol-1and the binding site (n) was about 1, respectively. The thermodynamic parameters suggested that the interaction force between AMF and BSA was electrostatic force. The results of synchronous fluorescence spectra showed AMF can change the conformation of BSA, the hydrophobicity around the tryptophan residues was increased. Conclusion: Fluorescence quenching method could be applied to study the interaction between AMF and BSA. It is a convenient and delicate method.

Amentoflavone; bovine serum albumin; fluorescence quenching

2015-06-30

陈科力(1947-)，男，教授，博导，研究方向中药资源及其品质研究,E-mail:kelichen@126.com

国家科技重大专项“中药新药安全性检测技术与标准研究”子课题(2014ZX09304307-001-021)

O657.3

A

1672-4321(2015)03-0045-05