超滤质谱法研究人血清白蛋白与甘草提取物的相互作用

王 献，喻 花，潘子昂，郑飞燕

(中南民族大学 化学与材料科学学院， 武汉 430074)

超滤质谱法研究人血清白蛋白与甘草提取物的相互作用

王 献，喻 花，潘子昂，郑飞燕

(中南民族大学 化学与材料科学学院， 武汉 430074)

为研究和筛选甘草提取物中的活性成分，采用超滤质谱法(UF-MS)研究了人血清白蛋白和5种甘草提取物(甘草苷、甘草酸、甘草素、甘草呋喃酮和甘草利酮)的相互作用.结果表明：这5种甘草提取物均与人血清白蛋白有不同程度的结合，其中甘草酸的结合能力最强，其次是甘草苷、甘草素、甘草呋喃酮和甘草利酮.说明超滤质谱法可准确识别与受体蛋白质结合的活性小分子配体，实现天然产物活性成分的快速筛选.

超滤质谱；人血清白蛋白；甘草提取物；蛋白质-配体复合物

超滤质谱技术是利用亲和原理，将具有潜在活性的小分子化合物混合物与受体混合得到受体-配体复合物和未结合的小分子，滤除未结合的小分子后，用酸或有机溶剂处理复合物，释放小分子配体，分离和鉴别活性分子.同光谱法[1]、电化学法[2]等相比，超滤质谱法具有灵敏、快速、高通量，适用于从复杂体系中筛选活性成分的特点[3].

血清白蛋白在血浆含量最为丰富，它与内源和外源性化合物结合后具有存储和转运的功能.乌拉尔甘草广泛分布于我国北方地区，其干燥块根与茎俗称甘草，具有抗炎、抗病毒、抗过敏、抗氧化性、养胃、抗癌等药用价值[4-10].本文以人血清白蛋白为靶点，通过超滤技术结合高效液相-质谱联用技术(HPLC-MS)从甘草中筛选出5种潜在的活性成分，应用HPLC-MS鉴定分析了各组分结构并比较了它们与HSA的结合能力的大小.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 6520四极杆-飞行时间质谱仪(Q-TOF MS, 美国安捷伦科技有限公司)，高效液相色谱仪(Agilent 1200, 美国安捷伦科技有限公司)，超滤膜 (YM-10, 美国Millipore 公司, 理论截取分子量10 kDa)，高速冷冻离心机(GL-20M, 上海卢湘仪离心机仪器有限公司)，紫外可见分光光度计(UV1700-1800, 上海凤凰光学科技有限公司)，智能集热式恒温加热磁力搅拌器(DF-101S, 上海东玺制冷仪器设备有限公司).

人血清白蛋白(HSA,美国Sigma)，甘草(湖北德仁堂大药房)，纤维素酶(上海阿拉丁试剂)，甲醇、乙腈(色谱纯, 德国Merck公司)，其他试剂均为优级纯.

1.2 仪器条件

质谱条件和色谱柱参数详见参照文献[3]，液相色谱梯度洗脱条件流动相A为超纯水，B为乙腈；t= 0 min，95% A (5% B)；t= 0～10 min，20% A (80% B)；t= 10～20 min，5% A (95% B)；t= 20～30 min，5% A (95% B)；t= 30～40 min，95% A(5% B).

1.3 甘草提取物的制备及超滤实验

采用纤维素酶加超声法提取甘草有效成分，经一系列优化实验获得最佳提取条件，此条件下提取甘草的有效成分得提取液，经0.45 μm滤膜过滤，用色谱纯甲醇稀释2倍，再用超纯水稀释500倍，得甘草提取物工作液，离心， 4℃下冷藏保存.将HSA溶解于超纯水中，配制成100 μM的蛋白质母液，用超纯水稀释5倍得20 μM工作液，离心，4℃下冷藏保存.提取物溶液与 HSA蛋白孵育后进行超滤实验，进HPLC-MS分析，超滤实验步骤详见参考文献[3].

2 结果与讨论

2.1 酶解-超声提取法的优化

本文对提取实验条件进行了一系列的优化，采用的酶解-超声法提取甘草，以获得最高提取率.通过逐一改变酶解超声法的酶解温度、溶液的pH值、酶解时间、乙醇浸泡时间和超声时间，用紫外-可见分光光度法测定提取率，各实验条件对提取率的影响如图1所示.据图1提取率-pH和提取率-温度的变化趋势，当pH=4.5和酶解温度为45℃时提取率最高；根据提取率-酶处理时间、提取率-乙醇浸泡时间和提取率-超声时间的变化趋势，处理时间越长则提取率越高，但时间到达一定程度时，变化趋势变缓，本着经济、环保、省时的原则，选取酶处理时间为2.0 h，乙醇浸泡时间为1.0 h，超声时间为30 min. 综上，酶解-超声法甘草的最佳条件如下：pH=4.5、酶解温度为45℃，酶处理时间为2.0 h，乙醇浸泡时间为1.0 h，超声时间为30 min.

a) pH; b) 温度; c) 酶处理时间; d) 乙醇浸泡时间; e) 超声时间图1 酶解-超声法提取甘草实验条件的优化Fig.1 The optimization of enzyme-ultrasonic exaction method for extracting licorice

2.2 液相色谱质谱联用仪(LC-ESI-MS)分析甘草提取物

用液质联用仪分析甘草提取物，首先优化甘草提取物LC-ESI-MS分析测试方法.采用ESI负离子模式，在优化条件下对标准品混合溶液进行分离检测，利用化合物与C18柱固定相相互作用的强弱不同，出峰时间也不相同，极性大的先出峰，极性弱的后出峰，16 min内甘草提取物混合溶液在C18柱中得到了完全分离，峰形较为对称，结果见图2.5种甘草提取物分子式、理论同位素分子量M及形成特征负离子质荷比见表1.

表1 5种甘草提取物对应的分子式、分子量和离子峰

n/a : not applicable

在总离子流图中提取表1中5种提取物的分子量得到EIC图(见图2)，EIC图中5组峰的ESI-MS质谱图(见图3)对应的特征负离子峰m/z分别为417.1241, 410.1984, 255.0708, 355.1289, 381.1391.将其与表1的理论值进行比对，鉴定这些峰分别为甘草苷、甘草酸、甘草素、甘草呋喃酮、甘草利酮.

1) 甘草苷; 2) 甘草酸; 3) 甘草素; 4) 甘草呋喃酮; 5) 甘草利酮图2 5种甘草提取物提取离子流图Fig.2 Extracted ion chromatogram (EIC) of five licorice extracts

图3 EIC 中1～5号离子流峰对应的ESI-MS质谱图 Fig.3 The corresponding ESI-MS spectra for 1～5 ion peaks in EIC

2.3 甘草提取物与人血清白蛋白的超滤实验

超滤质谱是一种基于质谱的亲和筛选方法，超滤过程在实验中起关键作用.当甘草提取物的混合溶液与靶蛋白混合时，活性成分小分子与靶蛋白形成复合物，被超滤膜截取下来，未结合的小分子可通过超滤膜离心洗脱.当再加入有机溶剂使蛋白质变性，蛋白-配体复合物发生解离，解离出的药物分子超滤后进入液质联用仪分析，HPLC-MS检测条件与标准溶液一致.在所得的总离子流图(TIC)中提取5种甘草提取物精确分子量，结果见图4.图4中相同HPLC-MS检测条件下，溶液中该物质浓度与提取离子色谱峰的积分面积成正比，加入蛋白质组的EIC色谱峰(实线)的信号强度均不同程度高于未加蛋白质组(虚线).由二者提取离子色谱峰面积差异大小可知，甘草酸结合HSA能力较强，其次是甘草苷、甘草素、甘草呋喃酮和甘草利酮.

1) 甘草苷; 2) 甘草酸; 3) 甘草素; 4) 甘草呋喃酮; 5) 甘草利酮图4 5种甘草提取物与HAS结合后的超滤质谱提取离子流图Fig.4 EIC spectrum of the 5 licorice extracts binding with HSA by ultrafiltration mass spectrometry

5种甘草提取物与HSA相互作用后溶液的超滤质谱提取离子流图(见图4)中5组峰的ESI-MS质谱图(图略)与标准溶液(图2)一致，保留时间分别为10.300, 10.765, 12.113, 14.729, 15.355 min色谱峰的质谱图.通过Q-TOF MS给出的精确分子量信息确定，质荷比m/z为417.1206的是甘草苷的[M-H]-峰，质荷比m/z为273.1302、410.1942的是甘草酸的特征多电荷负离子峰，质荷比m/z为255.0674的是甘草素的[M-H]-峰，质荷比m/z为355.1280的是甘草呋喃酮的[M-H]-峰，质荷比m/z为381.1361的是甘草利酮的[M-H]-峰.依据质谱特征离子峰，按照保留时间鉴定该5种物质依次为甘草苷、甘草酸、甘草素、甘草呋喃酮和甘草利酮，与标准品混合溶液直接进ESI-MS分析的色谱峰保留时间一致.

3 结语

本文通过构建超滤-HPLC-MS联用检测法研究了人血清白蛋白(HSA)与甘草提取物的相互作用，检测出了与HSA有较强结合的5种有效成分：甘草苷、甘草酸、甘草素、甘草呋喃酮和甘草利酮，并通过比较提取离子流图色谱峰确定了各成分与HSA结合能力的强弱.本研究以人血清白蛋白作为靶蛋白，亲和超滤筛选后，将活性化合物分子从复杂的混合物中分离开来，用液质联用技术分析鉴定了有效成分，为研究和筛选中草药有效成分提供了一种新方法.

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Study on the Interaction between Human Serum Albumin and Licorice Extracts by Ultrafiltration Mass Spectrometry

WangXian,YuHua,PanZiang,ZhengFeiyan

(College of Chemistry and Materials Science, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

In order to study and screen the active ingredient in licorice extract, the interaction between human serum albumin and 5 licorice extracts (liquorice glycosides, glycyrrhizic acid, licorice, licorice furfuran ketone and licoricone) were studied using ultrafiltration mass spectrometry (UF-MS). The results showed that all of the 5 licorice extracts could bind with human serum albumin (HSA). Among them, glycyrrhizic acid had the highest binding affinity, followed by liquorice glycosides, licorice, licorice furfuran ketone and licoricone. Our work demonstrated that UF-MS could accurately identify the small active molecule ligands of the receptor protein, thus rapidly screen active ingredients from natural products.

ultrafiltration mass spectrometry(UF-MS); human serum albumin (HSA); licorice; protein-drug interactions

2013-07-13

王 献(1978- )，女，教授，博士，研究方向：质谱分析，E-mail:xwang27@hotmail.com

国家自然科学基金资助项目(20705041, 21275167)，湖北省自然科学基金资助项目(2014CFA025)

TQ028；O657.63

A

1672-4321(2015)03-0025-04