吉非替尼对敲低联蛋白A 7的HepG 2细胞增殖的影响*

焦海涛，王爱民，张宇新，李欣

(1．河北联合大学基础医学院，河北唐山 063009 2．承德医学院，河北承德 067000 3．河北省承德市中心医院，河北承德 067000)

吉非替尼对敲低联蛋白A 7的HepG 2细胞增殖的影响*

焦海涛1，2，王爱民3，张宇新1＊＊，李欣2

(1．河北联合大学基础医学院，河北唐山 063009 2．承德医学院，河北承德 067000 3．河北省承德市中心医院，河北承德 067000)

目的:探讨表皮生长因子受体抑制剂吉非替尼对敲低膜联蛋白A7后的人肝癌细胞株HepG2细胞增殖的影响，为肝癌的分子靶向治疗提供实验依据。方法:将细胞分为吉非替尼组、siRNA转染、siRNA转染+吉非替尼、转染阴性对照组和空白对照组，用脂质体转染法靶向将ANXA7的siRNA转染入HepG2细胞，在转染后6h在siRNA转染组和siRNA转染组+吉非替尼组加入一定浓度的吉非替尼，加药后72h进行MTT实验以检测细胞增殖活力，从而计算增殖抑制率。结果:MTT检测得知，siRNA转染组、吉非替尼组和siRNA转染+吉非替尼组，对细胞增殖有明显的抑制作用，较对照组差别有统计学意义(P＜0．05)。结论:吉非替尼对敲低ANXA7后的HepG2细胞的增殖具有更为明显的抑制作用。

吉非替尼;膜联蛋白A7;HepG2细胞;增殖抑制

肝癌是全球发病率排名第五的恶性肿瘤，目前没有特效药物能够阻止肿瘤的复发和转移扩散，严重影响肝癌患者的生存和预后［1］。近年来随着分子生物学的迅猛发展，分子靶向药物在多种实体瘤中较为广泛的应用，使肿瘤治疗的未来充满希望。吉非替尼在临床上已广泛用于肺癌的治疗，也有研究证实，吉非替尼能抑制肝癌细胞增殖［2～4］。膜联蛋白A7(annexin A7，ANXA7)是膜联蛋白家族成员之一，是一种能促进膜融合的钙依赖性磷脂结合蛋白。近年来研究发现，在正常体外培养的情况下，敲低人肝癌HepG2细胞中ANXA7蛋白的表达量，该细胞的生长与增殖受到一定程度的抑制［5］。本研究将敲低人肝癌HepG2细胞中ANXA7的表达水平和吉非替尼相结合，观察HepG2细胞增殖的变化，为改善肝癌的疗效提供新的治疗方式和实验依据。

1 资料和方法

1．1 试剂和仪器设备:转染试剂lipofectaminE2000 (1ipo2000)、靶向ANXA7的siRNA、MTT粉剂均为Invitrogen公司产品;ANXA7小鼠单克隆抗体购自美国sigma公司;DMEM为美国Gibco公司产品;二甲基亚砜(DMSO)购自北京博奥森生物科技有限公司;MK3酶标仪为Thermo公司产品;CO2培养箱型号HERA-ceu150，为德国贺利公司产品，细胞培养板购自北京华美公司。

1．2 细胞培养与药物:人肝癌HepG2细胞由承德医学院基础研究所提供，细胞培养于含10%胎牛血清(FBS)的DMEM中，置含5%CO2、37℃细胞培养箱中培养。吉非替尼(Iressa)购自阿斯利康公司，250mg/片，分子式C22H24ClFN4O3，分子量为446，将吉非替尼用DMSO溶解，配制成20mM的溶液，－20℃冰箱储存，用时常温解冻后，用DMEM稀释至所需浓度，并使DMSO的最终浓度不超过0．1%，对实验结果无显著影响。

1．3 MTT法检测吉非替尼对HepG2细胞增殖的影响:收集对数生长期的HepG2细胞，经0．25%胰酶消化吹打成单细胞悬液，调整浓度为1×105/孔，接种于96孔培养板中，每孔200μL，置37℃、5%CO2培养箱内培养24h后，吸去培养液。分为阴性对照组和实验组，每组6个复孔。对照组只加入培养液200μL，实验组加入含有不同浓度吉非替尼的培养液200μL，使吉非替尼终浓度分别0．01、0．1、0．5、1．0、5．0、10．0、50．0μM;继续培养72h后，每孔加入MTT20μL(5mg/ mL)，置37℃、5%CO2避光继续培养4h后，小心吸去上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，震荡10min后于酶标仪上测OD值(波长=490nm)。并按照以下公式计算各浓度药物对HepG2细胞的抑制率:平均细胞抑制率IR=(1－用药组OD值/对照组OD值)×100%，实验重复3次，以药物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制细胞生长抑制图，应用直线回归法计算半数抑制浓度(IC50)。

1．4 吉非替尼对抑制膜联蛋白A7后的HepG2细胞细胞增殖的影响

1．4．1 细胞转染:将培养于60mm细胞培养板中的HepG2细胞，在转染前1d按4×104/孔种于6孔板中，使细胞密度在24h内达到70%以内。将细胞分为siRNA转染组、阴性siRNA转染对照组、未转染空白对照组和吉非替尼处理组。配置体积为250μL的无血清DMEM与siRNA寡核苷酸的混合物，其中包含30pmoL/L siRNA寡核苷酸，轻柔混匀，室温放置5min后与Lipo2000转染试剂混合，再在室温放置20min，然后将混合物分别加至所需要的培养孔中。转染后6h换液，空白对照组、阴性siRNA转染对照组、siRNA转染组换为含血清的DMEM，吉非替尼处理组，siRNA转染加吉非替尼处理组换为吉非替尼终浓度为5μM含血清的DMEM。

1．4．2 MTT实验:各组细胞用0．25%胰酶消化细胞，以1×105/孔的密度种96孔板，每组设6个复孔，转染方法和转染后处理如前。72h后，每组分别加入20μL (5mg/mL)MTT后，放入37℃、5%CO2培养箱继续培养4h，然后取出小心吸去上清液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，振荡10min，选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光密度(OD)值，计算各组细胞抑制率。

1．4．3 统计学处理:所有数据采用均值±标准差表示。用SPSS13．0软件进行数据处理，多组之间比较采用单因素方差分析，组间变量比较采用q检验，P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 吉非替尼对HepG2细胞增殖的抑制作用:MTT结果显示，不同浓度的吉非替尼作用于HepG2细胞72h后有显著差异，随着药物浓度的增加，细胞的相对抑制率也相应提高，当吉非替尼的用量升高至5μM时，细胞增殖的抑制率接近50%，如图1所示。

图1 72h不同浓度梯度吉非替尼对HepG2细胞的增殖的改变(*:P＜0．05，＊＊:P＜0．01)

图2 MTT法检测各组细胞增殖的改变(*:P＜0．05，*＊:P＜0．01)

2．2 吉非替尼对转染后的HepG2细胞的作用:分别对各组的OD值进行分析显示:siRNA转染+吉非替尼组和吉非替尼组OD值明显低于吉非替尼转染阴性对照和空白对照组细胞，说明siRNA转染+吉非替尼组和吉非替尼组对HepG2细胞增殖有明显的抑制作用，并且siRNA转染+吉非替尼组的抑制作用最为显著(p＜0．01)。吉非替尼转染阴性对照和空白对照组之间无明显差异(P＞0．05)，见图2。

3 讨论

肝癌仅次于胃癌，在我国恶性肿瘤发病率中排名第二。其恶性度极高、预后极差，术后生存期短、易复发和转移，因此，重视肝癌治疗的基础研究，结合临床需要，探索发现与肝癌治疗相关的、有效的分子靶向药物成为近年来研究的热点。

吉非替尼(Gefitinib)是近年发现的一种小分子选择性表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶抑制剂，能选择性抑制ATP与受体酪氨酸激酶的结合，阻断肿瘤细胞的增殖和生存信号的传导，同时也有促进细胞凋亡和抗肿瘤血管生成的作用。吉非替尼在临床上已广泛用于接受过一线化疗效果不好或不适宜采用化疗的晚期或转移性非小细胞肺癌(non－small cell lung cancer，NSCL)患者［6］。EGFR在多恶性肿瘤组织中存在过度表达，其中就包括肝癌，而且EGFR已被证实是低分化的HCC患者肿瘤早期复发、预后不良的因素之一，在此基础上的研究证实，吉非替尼在体外正常培养下，对肝癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌等肿瘤细胞已显示出增殖抑制作用。

膜联蛋白A7(ANXA7)是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白超家族之中的一员，ANXA7涉及促进嗜铬细胞颗粒膜的结合、聚集、融合和钙离子动态平衡等多种生物学功能。ANXA7在多种肿瘤组织中表达异常，如乳腺癌和宫颈鳞癌组织中表达增高，而在前列腺癌和胃癌组织中表达降低，由于其表达的差异性很强而被认为是前列腺癌、乳腺癌、胃癌等诊断和预后的分子标志物。ANXA7编码基因位于10号染色体上，该染色体结合位点含多个与肿瘤有关的抑癌基因，因此ANXA7被认为是一个候选的抑癌基因，随着研究的深入，在不同恶性肿瘤中的异常表达又使得ANXA7变得不能确定，它与不同肿瘤的联系及相关机制还在继续的探索之中。

在以上研究的基础上，本实验首先证实吉非替尼单独作用于HpeG2细胞，细胞的增殖受到了一定的抑制。而且王小杰等［5］研究表明敲低人肝癌HepG2细胞中ANXA7蛋白的表达，该细胞的生长与增殖受到一定程度的抑制。于是我们想证实一下对肝癌细胞分别有抑制作用的两种因素，即分子靶向药物吉非替尼和敲低ANXA7，如果将二者联合应用是否能协同抑制HpeG2细胞增殖。研究发现吉非替尼组、siRNA转染组、siRNA转染+吉非替尼组对HpeG2细胞有明显的抑制作用，且siRNA转染+吉非替尼组的抑制效果要高于单因素组，对HpeG2细胞的增殖抑制作用更为显著。由此我们推测，ANXA7与吉非替尼两种处理因素可能存在协同作用，通过敲低ANXA7的表达可以增加HpeG2细胞对吉非替尼的敏感性。关于二者协同作用的机制，还有待我们进一步深入研究。

［1］El－Serag HB，Mason AC．Rising incidence of hepatocellular carcinoma in the United States［J］．N Engl Med，1999，340: 745～750．

［2］何怡，王东，张沁宏，等．EGFR抑制剂吉非替尼对肝癌细胞增殖和凋亡的影响［J］．第三军医大学学报，2006，28 (2):125～128．

［3］朱步东，袁守军，徐建明，等．易瑞莎对H22肝癌小鼠的抑癌作用［J］．中华医学杂志，2004，84(8):684～686．

［4］郭桂英，石静滨，陈凤霞，等．吉非替尼对肝癌Bel7402细胞株放射增敏作用的实验研究［J］．中华肿瘤预防杂志，2011，18(11):844～850．

［5］王小杰，李欣．膜联蛋白A7低表达对人肝癌HepG2细胞增殖的影响［J］．解剖学报，2013，44(5):656～660．

［6］董强刚．上皮生长因子受体家族与肺癌的分子靶向治疗［J］．肿瘤，2004，24(2):B93～95．

Effect of Gefitinib on Proliferation of the Annexin A7 Knockdown HepG2 Cell

JIAO Haitao，et al
(Basic Medical Sciences of Hebei United University，Hebei Tangshan 063009，China)

Objective:To explore the effect of EGFR inhibitor gefitinib on proliferation of the annexin A7 knockdown HepG2 cell，and to provide the evidence for potentialmolecular target therapy in the HCC clinical treatment．Method:The HepG2 cells were divided into gefitinib group，a siRNA transfection group，siRNA transfection combined gefitinib group，negative group and control group．The siRNA was transfected into HepG2 cells by lipofectamine transfection method．Six hours after transfection，added a certain concentration of gefitinib into siRNA transfection group and siRNA transfection combined gefitinib group．Seventy－two hours after adding gefitinib，MTT assay was used to detect proliferation activity，and calculation the cell proliferation inhibition rate．Result:MTT assay showed that proliferation of the group of siRNA transfection，gefitinib and siRNA transfection combined gefitinib decreased significantly(P＜0．05)．Conclusion:Gefitinib can inhibit proliferation of ANXA7 knockdown HepG2 cells．

Gefitinib;Annexin A7;HepG2 cells;Proliferation inhibition

B

10．3969/j．issn．1006－6233．2015．08．025

承德医学院院级课题，(编号:201218)

＊＊通讯作者

1006－6233(2015)08－1444－03