siRNA沉默肾上腺髓质素基因对A375黑素瘤细胞表达VEGF IL－10的影响*

高阳，胡晓梅，杨宁，孙宇，梁官钊，韩晨珠，段昕所

(承德医学院附属医院，河北承德067020)

siRNA沉默肾上腺髓质素基因对A375黑素瘤细胞表达VEGF IL－10的影响*

高阳，胡晓梅，杨宁，孙宇，梁官钊，韩晨珠，段昕所＊＊

(承德医学院附属医院，河北承德067020)

目的:研究siRNA沉默肾上腺髓质素基因对A375黑素瘤细胞表达VEGF、IL－10的影响。方法:采用人黑素瘤细胞株A375，分为采用正常未转染组细胞做为空白对照，人工合成的非特异序列转染A375细胞为阴性对照，人工合成的肾上腺髓质素(ADM)靶向小分子干扰RNA转染A375细胞为抑制ADM基因表达实验组。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法和免疫细胞化学染色方法检测各组细胞中VEGF、IL－10的表达水平。结果:空白对照组、阴性对照组、ADM siRNA转染组ELISA法测定VEGF的表达量分别为192.246±17.330、187.831±14.450、96.218±10.078 pg/mL;IL－10的表达量分别为108.822±7.55、103.250±4.785、37.024±5.770pg/mL，组间比较差异均有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。免疫组化法测定显示结果同ELISA结果。结论:siRNA沉默ADM基因可下调A375黑素瘤细胞免疫抑制分子VEGF、IL－10的表达。

小分子干扰;肾上腺髓质素;黑素瘤;血管内皮生长因子;白细胞介素－10

肾上腺髓质素(ADM)是在嗜铬细胞瘤组织中发现的一种内源性血管活性肽，研究发现绝大多数的肿瘤细胞能够产生ADM，并且在促进肿瘤生长的过程中发挥着肿瘤生长因子的作用。RNA干扰技术可以对基因进行沉默，目前研究已证实siRNA(small interference RAN，siRNA)沉默肾上腺髓质素基因能够将A375黑素瘤细胞阻滞在G2/M期，抑制细胞增殖、促进凋亡，降低A375黑素瘤细胞的体外侵袭能力［1，2］。肿瘤细胞分泌免疫抑制分子抑制机体免疫功能，使肿瘤细胞逃避机体的免疫监视，是肿瘤得以发生、发展和转移的重要机制。ADM基因的表达是否与免疫抑制分子介导的免疫逃逸有关值得进一步研究。

1 资料与方法

1.1 材料:黑色素瘤细胞系A375购于北京鼎国昌盛生物技术有限公司;小干扰RNA(siRNA)、转染试剂riboFECT TM CP Buffer(10×)、riboFECT TM CP Reagent购于广州市锐博生物科技有限公司;VEGF一抗(鼠抗人)、IL－10一抗(兔抗人)、ADM一抗(鼠抗人)购于美国Santa Cruz公司;二抗(抗鼠、兔)购于北京中杉金桥生物技术有限公司;DAB显色试剂盒购于福州迈新生物技术开发有限公司;ELISA主要试剂人VEGF ELISA试剂盒、人IL－10 ELISA试剂盒购于深圳市达科为生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞转染:取对数生长的A375细胞，胰酶消化，以含10%FBS的1640培养液吹打，并制备成浓度为1×105/mL的细胞悬液，以每1000μL加入24孔板中，每组siRNA设三个复孔。待细胞融合至50%～60%，用50 nM的ADMsiRNA转染A375细胞，siRNA序列参考李志加文献［1］，将配制好的siRNA工作液以每孔1.25μL的量混匀，室温孵育5min，每孔按照5μL riboFECT TM CP Reagent加入siRNA工作液配制成混合液，轻轻吹打混匀，室温孵育0～15min，将混合液以每孔6.25μL加入到443.75μL细胞培养液中，阴性对照组转染非特异序列，空白对照组加入500μL不含ADMsi－RNA的完全培养液，使每孔的终体积为500μL，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中进行培养，作用24h。

1.2.2 免疫细胞化学染色方法检测各组ADM、VEGF、IL－10蛋白的表达情况:细胞爬片固定后，所有切片染色均采用相同条件，按免疫组化步骤进行。结果判定以细胞内(胞浆、胞核、核膜)呈现棕黄色着色为阳性，不着色为阴性(～)。每组选三张片，每个细胞爬片随机选择5个高倍视野(10×40倍)，每个视野作为一例标本，以细胞质和(或)细胞膜中出现棕黄色颗粒为阳性，将阳性细胞占总细胞数的百分比和染色强度进行半定量处理。每个细胞爬片选择5个具有代表性的高倍视野(×400倍)，计算阳性率，评价方法参照Birner等［3］的方法，＜25%为1分，25%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分。染色强度染色弱但强于阴性对照者为1分，染色清晰者为2分，染色强者为3分。上述两项评分相加，＜3分为(－)，3分为(+)，4～5分为(++)，6～7分(+++)最后计算两种记分的和做为半定量分级。

1.2.3 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组细胞培养上清中VEGF、IL－10的含量。按照所购试剂盒的步骤，采取双抗体夹心ELISA法测定上清VEGF、IL－10的含量。

1.3 统计学处理:采用SPSS17.0统计学软件对结果进行处理，免疫细胞化学染色结果采用卡方检验进行分析;计量资料数据以±s表示，采用单因素方差分析，组间比较采用q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫细胞化学染色方法检测各组ADM、VEGF、IL －10蛋白的表达情况

图1 各组细胞ADM的表达结果

图2 各组细胞VEGF的表达结果

表1

图3 各组细胞IL－10的表达结果

2.1.1 免疫细胞化学染色法检测siRNA沉默效果:在转染不同RNA序列(ADM序列、非特异序列)及未转染的干预作用下，各组A375黑素瘤细胞连续培养24h，经免疫细胞化学染色法检测结果，图1中ADM-siRNA转染组ADM的表达量明显低于空白对照(χ2= 40.168，P＜0.01)和阴性对照组(χ2=40.168，P＜0.01)，差异具有统计学意义，而阴性对照和空白对照组ADM高表达，两组间差异具有统计学意义(χ2=30.498，P＜0.01)。图2中A375黑素瘤细胞可见VEGF阳性表达，阳性染色主要定位于胞浆、胞膜及胞核。ADMsiRNA转染组VEGF的阳性信号较空白对照组(χ2=41.589，P＜0.01)及阴性对照组(χ2=41.589，P＜0.01)低，差异具有统计学意义，而空白对照组和阴性对照组阳性表达较高，两组间差异有统计学意义(χ2=27.726，P ＜0.01)。

图3中A375黑素瘤细胞可见IL－10阳性表达，阳性染色主要定位于胞浆、胞膜及胞核。ADMsiRNA转染组IL－10的阳性信号较空白对照组(χ2=27.726，P＜0.01)及阴性对照组(χ2=30.498，P＜0.01)低，差异具有统计学意义，而空白对照组和阴性对照组阳性表达较高，两组间差异有统计学意义(χ2=19.408，P＜0.01)。

2.1.2 免疫细胞化学染色方法检测各组ADM、VEGF、IL－10蛋白的表达分级情况，见表1。

2.2 酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组细胞培养上清中VEGF和IL－10的含量:在转染不同RNA序列(ADM序列、非特异序列)及未转染的干预作用下，各组A375黑素瘤细胞连续培养24h收集培养上清，ELISA法检测，结果见表2。转染ADMsiRNA后A375黑素瘤细胞表达VEGF的量显著低于阴性对照组和空白对照组，差异有统计学意义(F=129.935，P＜0.01);两两比较，阴性对照组与空白对照组差异无显著性(P ＞0.05)，ADMsiRNA转染组与阴性对照组和空白对照组两组分别比较均具有显著性差异(P＜0.01)。

表2 各组上清液中VEGF和IL－10的含量(pg/mL，±s)

表2 各组上清液中VEGF和IL－10的含量(pg/mL，±s)

分组NVEGFIL－10空白对照组9192.246±17.329108.822±7.55阴性对照组9187.831±14.450 103.250±4.785 ADMsiRNA转染组996.218±10.07837.024±5.770

3 讨论

黑素瘤的形成过程存在着免疫逃逸机制，而肿瘤细胞主要通过分泌免疫抑制分子逃避机体免疫系统识别和攻击，目前已确定的免疫抑制分子有20余种，其中与黑素瘤密切相关的免疫抑制分子有血管内皮生长因子(VEGF)、白细胞介素－10(IL－10)和前列腺素E2 (PGE2)等。这些细胞因子通过自分泌－旁分泌等途径参与细胞的转型及逃避免疫监视，为肿瘤的发生及发展创造有利的微环境。新生血管的形成贯穿着肿瘤发生及发展的各个阶段［4，5］，VEGF被认为是促进血管生成作用最强的细胞因子［6～8］，肿瘤细胞分泌的VEGF不仅能够与血管内皮细胞表面的特异性受体结合，还能同时表达VEGF受体，这种共表达方式说明了VEGF可通过自分泌或旁分泌方式影响肿瘤的生物学行为，并且在一定程度上降低了机体免疫系统对肿瘤的排斥效应。IL－10是由免疫适应细胞及肿瘤细胞、上皮细胞等非免疫细胞产生，能够抑制多种效应分子，抑制生物体的抗肿瘤免疫。本研究利用RNA干扰技术沉默ADM基因，采用的小干扰RNA(siRNA)序列是参照李志加的研究，由生物公司设计三对siRNA序列，实时荧光定量(qRT)－PCR检测3对siRNA序列转染A375细胞后细胞内靶基因mRNA表达，以检测其转染效果，三组干扰率分别为15%、76%、50%，转染效果最佳的第二组其siRNA序列:正向链为5’－GCCAGAGCAUGAAC AACUUdTdT－3，反向链为3’－dT-dTCGGUCUCGUACUUGUUGA A－5’，干扰靶序列为GCCAGAGCATGAACAACTT，本实验继续采用此siRNA序列，转染A375黑素瘤细胞沉默ADM基因，作用24h干扰ADM基因后利用免疫细胞化学染色及ELISA方法检测。结果说明ADM基因表达下调可抑制A375黑素瘤细胞VEGF及IL－10的表达。郭双华［9］通过对人肾癌786－O细胞研究发现加入100nM 的ADM后VEGF及ADM蛋白mRNA表达增高，而加入阻滞剂培养后，VEGF的表达受到抑制，说明ADM可能通过调节VEGF的表达来参与肾癌新生血管生成、进而促进肿瘤发展，本实验也证实了这种调节机制，但是否是从转录水平影响mRNA表达，亦或是影响信号传导途径的某一关键因子还有待进一步研究。

IL－10基因启动子区域存在着多态性，这与肿瘤的进展密切相关，有研究发现，IL－10－1082AA基因型与乳腺癌的进程相关，作用24h干扰ADM基因后利用免疫细胞化学染色及ELISA方法检测发现IL－10的表达受到了抑制，说明免疫抑制分子IL－10的表达受到ADM基因的影响，前期的研究已证实siRNA沉默A375黑素瘤细胞ADM基因，抑制了细胞增殖，促进凋亡，将细胞阻滞在G2/M期，本实验继续深入研究基因干扰后其对肿瘤细胞表达免疫抑制分子的影响，通过细胞化学染色及ELISA法检测siRNA沉默A375黑素瘤细胞ADM基因是否对VEGF及IL－10的表达有影响。

［1］李志加，孙立新，陆洁，等.siRNA沉默肾上腺髓质素基因对黑素瘤细胞增殖和凋亡的影响［J］.中华皮肤科杂志，2012，45(12):878～881.

［2］白秀会，曹娜，李娜，等.siRNA沉默肾上腺髓质素基因对A375黑素瘤细胞周期的影响［J］.临床和实验医学杂志，2013，12(17):1345～1346，1349.

［3］Birner P，Schindl M，Obermair A，et al.Overexpression of hypoxia－inducible factor α is a marker for an unfavorable prognosis in early－stage invasive cervical cancer［J］.Cancer Res，2000，60(17):4693～4696

［4］Kim HN，Kim H，Kong JM，et al.Vitamin C down－regulates VEGF production in B16F10 murine melanoma cells via the suppression of p42/44MAPK activation［J］.Cell Biochem，2011，112(3):894～901.

［5］Lasagna N，Fantappiè O，Solazzo M.Hepatocyte growth factor and inducible nitric oxide synthase are involved in multidrug resistance－induced angiogenesis in hepatocellular carcinoma cell lines［J］.Cancer Res，2006，66(5):2673～2682.

［6］Tomoda M，Maehara Y，Kakeji Y，et al.Intratumoral neovascularization and growth pattern in early gastric carcinoma ［J］.Cancer，1999，85(11):2340～2346.

［7］毕锋，刘娜，等.RhoGTPases对肿瘤血管生成相关分子的作用［J］.中国生物化学与分子生物学报，2004，20(5): 664～669.

［8］Xue Y，Bi F，LiuN，et al.Effect of Rho GTP ases on tumor angiogenesis related molecules［J］.Chin BiochemmoL Biol，2004，20(5):664～669.

［9］敦双华，王东彬，乔娜，等.VEGF在肾癌细胞的表达及肾上腺髓质素对其的影响［J］.山东医药杂志，2012，52 (11):36～37.

Impact of Small Interference RNA－induced Silencing of Adrenomedullin Gene on the Expression of VEGF IL－10 in Malignant Melanoma Cells

GAO Yang，HU Xiaomei，YANG Ning，et al
(The Affiliated Hospital to Chengde Medical College，Hebei Chengde067000，China)

Objective:To assess the impact of small interference RNA－induced silencing of adrenomedullin gene on the expression of VEGF，IL－10 in malignant melanoma cells.Method:A375 cells were classified into 3 groups to be transfected with the selected siRNA(test group)，non－specific sequences (negative control group)，or remain untransfected(blank control group).Immunocytochemical staining and ELISA was performed to detect the expressions of VEGF and IL－10 in each group.Result:The expression of VEGF was 192.246±17.330 pg/mL in the control group，187.831±14.450 pg/mL in the negative control group and 96.218±10.078 pg/mL in ADMsiRNA transfected group.The expression of IL－10 was 108.822±7.55 pg/mL in the control group，103.250±4.785 pg/mL in the negative control group and 37.024±5.770 pg/ mL in ADMsiRNA transfected group.The differences were statistically significant.The results of immunohistochemistry are the same of ELISA.Conclusion:siRNA silencing adrenomedullin gene can inhibit the expression of VEGF and IL－10 in A375 melanoma cell.

small interfering;Adrenomedullin;Melanoma;VEGF;IL－10

B

10.3969/j.issn.1006－6233.2015.07.013

1006－6233(2015)07－1096－04

河北省科技支撑计划项目，(编号:09276101D－14)

＊＊通讯作者:Email:duanxinsuo2002@163.com