参龟固本酒对大鼠酒精性肝损伤的作用

王红英，刘 敏，刘 美，赵丽丽，赵正杭

（1.西安交通大学医学部药理学系，陕西西安 710061；2.西安德天药业股份有限公司，陕西西安 710119）

参龟固本酒对大鼠酒精性肝损伤的作用

王红英1，刘 敏2*，刘 美1，赵丽丽1，赵正杭1

（1.西安交通大学医学部药理学系，陕西西安 710061；2.西安德天药业股份有限公司，陕西西安 710119）

目的 观察参龟固本酒对大鼠酒精性肝损伤的作用。方法 SD大鼠按体质量随即分为3组：盐水对照组、白酒对照组及参龟固本酒组。各组分别灌胃给予生理盐水、相同酒精量的白酒、参龟固本酒液，每日2次，连续12周。末次给药后12 h处死大鼠，采血，取肝组织，测定肝、脾指数；检测血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、碱性磷酸酶（ALP）活性及总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）含量；检测血清及肝组织超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量；观察肝组织病理学改变。结果 连续灌胃12周后，盐水对照组大鼠毛发、食量、粪便及活动等一般情况均无异常，体质量正常增长，各项生化指标均在正常生理值范围内。白酒对照组大鼠体质量增长缓慢，与盐水对照组比较，雄性大鼠体质量明显减轻（P＜0.05），肝指数明显增高（P＜0.01），脾指数无明显变化，血清ALT、AST、ALP活性较对照组均显著增加（P＜0.01或P＜0.05），血清SOD、MDA、TP、ALB无显著差异，而肝组织中SOD活性显著降低（P＜0.05），MDA含量明显升高（P＜0.05）；同时，肝组织呈现大量大小不等的圆形脂滴空泡，可见点灶坏死及炎细胞浸润。参龟固本酒组大鼠体质量、肝、脾指数的变化明显轻于白酒对照组，与盐水对照组相比无明显差异（P＞0.05）；与白酒对照组比较，参龟固本酒组大鼠血清ALT、AST、ALP及肝匀浆MDA显著降低（P＜0.01或P＜0.05），而肝匀浆SOD显著增高（P＜0.05）；同时参龟固本酒组大鼠肝组织可见少量散在的脂滴空泡和炎细胞。结论 参龟固本酒对大鼠肝损伤明显轻于同酒精量的白酒，其机制可能与药酒所含中药的抗氧化作用有关。

参龟固本酒；酒精性肝损伤；抗氧化

随着社会的发展，生活节奏和压力不断增大，酗酒者的人数迅猛增加，已出现低龄化的特点，女性的比例也不断上升，而长期大量饮酒可引起机体多器官、多系统功能障碍以及严重的精神和社会问题。在我国，每年死于酒精中毒者占总死亡率的1.3%，致残人数占总致残率的3.0%。研究发现，酒中乙醇对机体组织器官有直接毒害作用，而肝脏对乙醇最敏感，长期大量饮酒能损伤肝细胞，干扰肝脏的正常代谢，进而可致脂肪肝、酒精性肝炎，是导致肝硬化的最主要原因［1-2］。因此，降低酒精成瘾及减轻长期饮酒对机体的危害具有重要的社会意义。目前，在市面上出现许多药酒，含有多种中药成分，有些已作为准字号药品，但大多数为保健品，它们对降低酒精成瘾或减轻长期饮酒对机体的危害可能有一定的作用，但其作用效果并无定论。参龟固本酒是由当归、黄芪、党参、茯苓、五味子、陈皮、防风等18种中药制成的酒剂，具有益气养血，健脾滋肾，祛湿活络作用，主要用于气血亏虚、肝肾不足所致的精神疲倦，头昏眼花，失眠健忘，食欲不振，夜尿频多，腰膝酸软，关节酸痛等病症。本研究通过大鼠长期经口服用等剂量的酒精诱发肝损伤，以观察参龟固本酒对大鼠肝脏损伤的作用及其对肝脏抗氧化功能的影响，为其临床人群服用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物、试剂及仪器受试品：参龟固本酒（32%），西安德天药业股份有限公司生产（批号：20130901）；对照品长安老窖（52%），西安德天药业股份有限司提供（批号：201302021）；谷丙转氨酶（ALT，批号：130824）、谷草转氨酶（AST，批号：130205）、碱性磷酸酶（ALP，批号：130261）、总蛋白（TP，批号：130161）和白蛋白（ALB，批号：130181）试剂盒，均由中生北控生物科技股份有限公司生产；超氧化物歧化酶（SOD，批号：20131128）、丙二醛（MDA，批号：20131128）及考马斯亮蓝试剂盒（批号：20131123）均购自南京建成生物工程研究所。Bio-Rad/伯乐酶标仪；CX9全自动生化分析仪（BECKMAN公司）。

1.2 实验动物SD品系大白鼠，由西安交通大学医学部实验动物中心提供，动物生产资格证号：SCXK（陕）2007-001，动物使用许可证号：SYXK（陕）2007-003。体质量170～200 g，雌雄各半。实验室室温20～25℃，相对湿度50%～85%。

1.3 动物分组及处理SD大鼠在适应性饲养5 d后分为3组：盐水对照组（10只）、白酒对照组及参龟固本酒组（均14只），雌雄各半，分别灌胃（ig）给予相应受试物，每日2次，共12周。盐水对照组（10 mL/kg生理盐水）；白酒对照组：白酒（40%），8 mL/kg；8周后，白酒（52%），8 m L/kg，共4周［以酒精量计：6.4 m L/（kg·d）×8周+8.32 m L/（kg·d）×4周］。参龟固本酒组：32%原药酒用32%白酒对半稀释，10 m L/kg；8周后，32%原药酒用52%白酒对半稀释，10 m L/kg［以酒精量计：6.4 m L/（kg·d）×8周+8.4 m L/（kg·d）×4周］。

1.4 观察指标及方法

1.4.1 一般情况及体质量 观察大鼠的一般情况，包括毛发、活动、食便等，每周称体质量，调整给药容量及观察体质量增长情况。

1.4.2 肝、脾指数的检测 实验结束末次给药禁食12 h后，200 g/L乌拉坦5 m L/kg iv麻醉，取肝、脾，用滤纸吸取残余血液称重，计算各组大鼠的肝、脾指数（组织湿重×100%/体质量）。

1.4.3 血清肝功生化的检测 股动脉取血分离血清，血清ALT、AST检测采用改良赖氏法；ALP采用连续监测法，TP采用双缩脲法检测；ALB采用溴甲酚绿法检测；SOD采用黄嘌呤氧化酶法测定；MDA采用TBA法检测。

1.4.4 肝组织SOD、MDA的检测 动物取血后，即刻取出整个肝脏，称重，取肝左叶组织约0.2 g，用预冷的生理盐水冲洗后制备成10%的肝匀浆，SOD采用黄嘌呤氧化酶法测定，MDA采用TBA法检测。

1.4.5 病理学观察 取肝右叶距肝脏边缘0.5 cm处组织一小块，放入100 m L/L甲醛固定，常规石蜡包埋、切片，HE染色，光镜下观察。

1.5 统计学处理数据处理使用SPSS 18.0软件，实验数据以均数±标准差（±s）表示，组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠的一般情况实验开始后，白酒对照组及参龟固本酒组大鼠活动减少，有的嗜睡，约1～2 h恢复正常。盐水对照组及各药酒组大鼠毛发有光泽、活泼好动、食便均未见异常，体质量持续增长；白酒对照组大鼠毛发光泽度较差，行动迟缓、食欲减退，易激怒，对抗白酒刺激强烈；与盐水对照组比较，雄性大鼠体质量增长缓慢，差异有统计学意义（P＜0.05，表1）。实验期间，对照组大鼠全部存活，白酒组大鼠死亡2只，给药酒组各死亡1只，尸体解剖发现均因酒精灌入气管立即死亡。

2.2 各组大鼠肝、脾指数的变化与盐水对照组比较，白酒对照组能明显增大肝指数（P＜0.01），但对脾指数无明显影响（P＞0.05）；参龟固本药酒组对大鼠肝、脾指数均无明显影响（P＞0.05），与白酒组比较，参龟固本酒组肝指数明显降低（P＜0.05），而同盐水对照组比较无明显差异（P＞0.05，表1）。

表1 参龟固本酒对大鼠体质量及肝、脾指数的影响Tab.1 Effects of Shen Gui Gu Ben Wine on body weight，liver，spleen indexes of rats（±s）

表1 参龟固本酒对大鼠体质量及肝、脾指数的影响Tab.1 Effects of Shen Gui Gu Ben Wine on body weight，liver，spleen indexes of rats（±s）

与盐水对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与白酒组比较，#P＜0.05。

组别动物数体质量（g）雌性雄性肝指数（g/g，%）脾指数（g/g，%）盐水对照组10 270.7±26.6 444.6±25.0 2.56±0.15 0.14±0.03白酒对照组12 251.6±21.1 395.8±41.3*2.97±0.32**0.15±0.04参龟固本酒组13 272.7±16.5 416.8±36.7 2.73±0.22#0.14±0.03

2.3 各组大鼠血清ALT、AST、ALP、TP、ALB的比较与盐水对照组比较，白酒组及参龟固本酒组大鼠TP、ALB含量均无明显变化（P＞0.05），但血清ALT、AST均明显升高（P均＜0.01）；与白酒组比较，参龟固本酒组血清ALT、AST、ALP均降低（P＜0.05，表2）。

表2 参龟固本酒对大鼠血清TP、ALB、ALT、AST、ALB的影响Tab.2 Effects of Shen Gui Gu Ben Wine on TP，ALB，ALT，AST and ALB in rat serum

2.4 各组大鼠血清及肝组织SOD、MDA的比较与盐水对照组比较，白酒对照组及参龟固本酒组对大鼠血清SOD、MDA含量均无明显影响（P＞0.05，表3）。

参龟固本药酒组对大鼠肝组织中SOD及MDA活性均无明显影响，与盐水对照组比较无统计学意义（P＞0.05），而白酒对照组大鼠肝组织中SOD活性较盐水对照组显著降低（P＜0.05），MDA活性明显升高（P＜0.05），参龟固本酒组较白酒对照组SOD明显升高（P＜0.05），MDA明显降低（P＜0.05），同盐水对照组比较无统计学意义（P＞0.05，表3）。

表3 参龟固本酒对大鼠血清及肝组织SOD、MDA的影响Tab.3 Effects of Shen Gui Gu Ben Wine on SOD and MDA in rat serum and liver （±s）

表3 参龟固本酒对大鼠血清及肝组织SOD、MDA的影响Tab.3 Effects of Shen Gui Gu Ben Wine on SOD and MDA in rat serum and liver （±s）

与盐水对照组比较，*P＜0.05；与白酒组比较，#P＜0.05。

组别动物数SOD（u/L）MDA（u/L）血清肝组织盐水对照组10 93.43±16.22 70.92±14.48 4.62±1.13血清肝组织0.89±0.15白酒对照组12 90.27±12.36 53.78±13.08*4.97±1.36 1.40±0.35*参龟固本酒组13 102.96±14.21 63.74±7.21#3.93±0.97 1.09±0.30#

2.5 各组肝组织病理学的变化对照组大鼠肝小叶结构如常，肝小叶结构清晰，肝细胞以中央静脉为中心呈放射状排列，形成肝细胞索。肝血窦间隙丰富，肝细胞形态规则，核呈圆形，可见双核，胞质丰满，无异常改变，门管区未见异常改变，未见肝细胞变性坏死，未见结缔组织增生，炎细胞浸润不明显。白酒组肝组织小叶中，肝细胞索排列紊乱，胞质内有大小不等的圆形脂滴空泡，部分组织呈出血坏死，可见点灶坏死及炎细胞浸润；参龟固本酒组肝细胞可见轻度脂变及炎细胞浸润，肝内结缔组织增生不明显（图1）。

图1 参龟固本酒对大鼠肝组织病理学的影响Eig.1 Effects of Shen Gui Gu Ben Wine on rat liver histopathology（HE，×400）

3 讨 论

酒精性肝病的机制十分复杂，目前还没有完全阐明，但普遍认为乙醇肝内毒性代谢物及其代谢过程产生的大量自由基或活性氧是酒精性肝损伤的主要机制之一［3］。当肝组织内乙醇浓度较低时，大部分乙醇由乙醇脱氢酶（ADH）氧化代谢。研究认为，长期大量酗酒，机体肝内乙醇浓度超过10 mmol/L时，主要依靠微粒体乙醇氧化系统的关键酶CYP2E1（细胞色素P450）代谢，在此代谢过程中，乙醇可氧化成乙醛，在醛氧化酶的作用下，乙醛可进一步被氧化，该过程伴随大量氧自由基的产生，包括羟自由基（-OH·）、氧自由基（O2·）及H2O2，氧自由基除可引起肝细胞膜的脂质过氧化外，还可与细胞膜上的CYP2E1结合诱导细胞毒反应，使肝细胞损伤。同时，乙醇代谢障碍导致肝细胞线粒体损伤后，可引起肝细胞内脂肪酸氧化障碍，脂肪合成基质增加，脂肪合成酶活性亢进，脂肪分解低下，使肝细胞脂肪变性，即出现酒精性脂肪肝。

本研究结果显示，白酒对照组大鼠灌胃12周后，血清ALT、AST显著升高，而同酒精量的参龟固本酒组血清ALT、AST明显低于白酒对照组；病理结果也显示，参龟固本酒组大鼠脂肪变性和炎症程度明显轻于白酒组，说明参龟固本酒中所含中药对酒精引起肝损伤有明显的抑制作用。实验进一步发现，参龟固本酒组肝组织MDA水平显著低于白酒组，而SOD水平明显高于白酒对照组，提示参龟固本酒所含中药可能通过抑制酒精致肝细胞氧化应激反应，增强细胞的抗氧化能力而发挥其保护肝损伤的作用。

参龟固本酒中含有当归、黄芪、党参、茯苓、山茱萸、五味子、川芎、白术、陈皮、防风、地黄、羌活、茯神、麦冬等18种中药成分。研究认为，五味子能促进胆汁分泌，加速肝内酒精等有毒物质的排泄；五味子亦能有效地降低升高的肝转氨酶，其活性成分木脂素可以增强GSH-PX和SOD等酶的生物活性，具有保护肝细胞膜、抗脂质过氧化、促进蛋白质生物合成和肝糖原生成等作用，能促进损伤的肝细胞修复、增长，抑制肝细胞病变［4］。茯苓对四氯化碳所引起的小鼠肝损伤有明显的保护作用，能使ALP活性明显降低，防止肝细胞坏死［5］。体内外研究结果表明，黄芪多糖具有显著的抗氧化活性，对OH·有一定的清除作用，其抗氧化效能较Vit.C强，且性质稳定，也能提高抗氧化相关酶的活性，降低相关组织的过氧化脂质水平［6］。汪建红等［7］用不同浓度党参总黄酮给小鼠灌胃25 d，发现野生党参总黄酮能增强小鼠血清和肝脏SOD活性，降低MDA含量，延长小鼠负重游泳时间，提高肝糖原、肌糖原的储备量，表明党参黄酮类化合物具明显的抗氧化抗疲劳生理功效。陈皮富含黄酮类化合物，黄酮类化合物是强自由基清除剂，具有很强的抗氧化活性。研究表明，陈皮黄酮化合物在体内外均有明显的抗氧化作用，小鼠灌胃30 d能降低小鼠肝脏、肾组织中MDA的含量，升高全血、肝脏组织中SOD、过氧化氢酶活性（CAT）［8］。白术具有明显的抗氧化作用，白术发挥其抗氧化作用是通过金属螯合和自由基清除实现的；自由基的清除来源于其内含的酚酸（特别是咖啡酸，阿魏酸，原儿茶酸），而金属螯合能力主要来自于黄酮类化合物［9］。目前认为，枸杞抗氧化作用主要与枸杞多糖、β胡萝卜素等单体有关，但杨薛康等［10］认为含有多种有效成分的枸杞醇提物抗氧化能力更强于水提物。而众多研究表明，川芎醇提物对超氧阴离子、脂质体过氧化均具有较强的清除作用［11］；山茱萸多糖有体外清除自由基和抗氧化作用［12］；羌活醇提物能增强肝缺血再灌注损伤大鼠肝组织抗氧化酶的活性［13］；生地黄乙酸乙酯提取物具有较强的抗氧化活性，可作为一种新的自由基清除剂和天然抗氧化剂［14］；防风多糖也有明显的抗氧化活性［15］。因此，这些药物的抗氧化或降酶保肝作用可能是参龟固本酒较白酒对大鼠肝损伤轻的主要原因。

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（编辑 卓选鹏）

The protective effect of Shen Gui Gu Ben Wine on alcoholic liver injury in rats

WANG Hong-ying1，LIU Min2*，LIU Mei1，ZHAO Li-li1，ZHAO Zheng-hang1
（1.Department of Pharmacology，Xi'an Jiaotong University Health Science Center，Xi'an 710061；2.Xi'an Detian Pharmaceutical Co.，Ltd.，Xi'an 710119，China）

Objective To observe the effect of Shen Gui Gu Ben Wine on alcoholic liver injury in rats. Methods SD rats were randomly divided into control group，white wine group and Shen Gui Gu Ben Wine group. Administration of different wine or normal saline twice a day began in rats by gastric gavage at the same time for 12 weeks.Samples were taken at the end of 12th week.The followings were detected：liver and spleen index；activities of serum alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST）and alkaline phosphatase（ALP），the contents of total protein（TP）and albumin（ALB），superoxide dismutase（SOD）activity and malondialdehyde（MDA）content in serum and liver tissue；and the liver tissue pathology.Results After 12 weeks of continuous administration，rats'hair，appetite，faeces and physical activities in control group were unchanged.Compared with control group，rats in white wine group had significantly reduced weight（P＜0.05）；significantly increased liver index（P＜0.01），increased serum ALT，AST，ALP and MDA contents in liver；and decreased SOD activity in liver；but there were no obvious changes in spleen index，the levels of serum TP，ALB，SOD or MDA（P＞0.05）. Pathological changes of liver tissue showed there were many fat drops，inflammatory cells infiltration and focal necrosis in white wine-treated rats.However，compared with white wine，Shen Gui Gu Ben Wine significantly increased rat body weight；decreased liver and spleen indexes，the levels of serum ALT，AST and ALP；enhanced liver SOD activities and decreased liver MDA contents（P＜0.01 or P＜0.05）.Shen Gui Gu Ben Wine obviouslyalleviated hepatic steatosis and inflammation shown in white wine group.Conclusion Shen Gui Gu Ben Wine can improve alcoholic-induced liver injury in rats，the mechanism of which may be associated with the antioxidant compositions in Shen Gui Gu Ben Wine.

Shen Gui Gu Ben Wine；alcoholic liver injury；antioxidant

R575

A

10.7652/jdyxb201505026

2014-09-05

2015-01-07

陕西省自然科学基金（No.SJ08C223）Supported by the Natural Science Foundation of Shaanxi Province（No.SJ08C223）

赵正杭.E-mail：zzh@mail.xjtu.edu.cn；*共同第一作者.

优先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150721.1700.010.html（2015-07-21）