CD24和OPN在上皮性卵巢肿瘤的表达及其与侵袭转移的关系

王笑笑，邢兰瑛，仲 华，王治荣，樊江波

（1.西安交通大学医学部第二附属医院妇产科，陕西西安 710004；2.西安市第四医院妇产科，陕西西安 710004；3.西安未央正泰医院，陕西西安 710016；4.西北工业大学医院，陕西西安 710072）

CD24和OPN在上皮性卵巢肿瘤的表达及其与侵袭转移的关系

王笑笑1，2，邢兰瑛1，仲 华3，王治荣4，樊江波1

（1.西安交通大学医学部第二附属医院妇产科，陕西西安 710004；2.西安市第四医院妇产科，陕西西安 710004；3.西安未央正泰医院，陕西西安 710016；4.西北工业大学医院，陕西西安 710072）

目的 探讨CD24和OPN在上皮性卵巢肿瘤发生发展中的表达，进一步了解卵巢癌的发病机制及CD24和OPN的高表达对卵巢癌侵袭转移的影响。方法 应用免疫组织化学（SP）法，检测正常卵巢组织、良性上皮性卵巢肿瘤、交界性上皮性卵巢肿瘤、上皮性卵巢癌中CD24和OPN的表达。结果 免疫组化结果显示，CD24蛋白的表达水平随着卵巢正常、良性、交界性和恶性性质的变化而逐步上升，各组间差异具有统计学意义（P＜0.05）；随着临床分期升高而表达率升高，病理分级升高而表达率降低，表达无组织学特异性。OPN蛋白的表达水平随着正常、良性、交界性和恶性性质的变化而逐步上升，各组间差异具有统计学意义（P＜0.05）；临床分期升高表达率升高，病理分级升高表达率降低，表达无组织学特异性。CD24和OPN表达阳性率间呈正相关（P＜0.05）。结论 CD24、OPN蛋白的高表达在卵巢肿瘤的发生、发展、侵袭转移中起重要作用；CD24和OPN的表达可以预测卵巢癌的发展、预后及复发风险。

卵巢肿瘤；CD24；OPN；免疫组织化学；转移

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一，其中90%左右卵巢恶性肿瘤是卵巢上皮性癌。卵巢癌早期不易诊断，且较易发生转移和广泛种植，5年存活率只有25%～30%。目前，认为持续排卵、内分泌因素，遗传因素及环境因素可能是卵巢肿瘤发病的高危因素，卵巢癌的发病机制仍不明确，可能与多因素引起某些基因表达水平的改变有关。细胞黏附分子24（cluster of differentiation 24，CD24）是选择素蛋白家族P选择素的配体，是一种低分子量高度糖基化的黏蛋白样的黏附分子，被认为是新的致癌基因和转移促进因子。研究发现CD24广泛表达在多种造血系统肿瘤和实体瘤中。并且和肿瘤的侵袭转移、复发和预后密切相关。骨桥蛋白（osteopontin，OPN）是一种糖蛋白，具有磷酸和唾液酸酶，被认为是细胞外的一种重要基质，有研究发现其对肿瘤生长和瘤体转移有一定的促进作用。CD24和OPN蛋白的阳性率与卵巢上皮性癌发展的关连，及CD24和OPN的阳性表达率与卵巢上皮性肿瘤进展有无相关性，国内鲜有报道。本实验目的是利用免疫组织化学染色法，研究CD24和OPN在卵巢上皮性肿瘤内表达及其对侵袭转移的影响，以及CD24和OPN在卵巢上皮性癌表达的相关性。从而进一步探索卵巢癌的发病机制，预测卵巢上皮性癌的发展及预后。

1 材料与方法

1.1 资料来源及标本采集随机选取西安交通大学医学部第二附属医院妇产科2009年1月至2012年9月间手术切除的正常卵巢组织、良性上皮性卵巢肿瘤组织、卵巢交界性上皮性肿瘤、卵巢上皮性癌标本109例。其中正常卵巢组织12例；良性卵巢上皮性肿瘤患者的标本19例，包括卵巢浆液性囊腺瘤，卵巢黏液性囊腺瘤，卵巢子宫内膜样肿瘤；卵巢交界性上皮性肿瘤标本有18例，包括交界性浆液性囊腺癌和交界性黏液性囊腺癌；卵巢恶性上皮性肿瘤60例，其中有浆液性囊腺癌、黏液性囊腺癌和子宫内膜样癌。109例卵巢组织的蜡块标本均是手术后2 h内的新鲜标本，并于4℃下使用100 m L/L甲醛（p H值7.2～7.4）固定6～12 h，且固定后经充分水洗并石蜡封存。

病例纳入与排除标准：①研究对象为首发病例，术前三个月内均未接受任何放化疗治疗；②无合并其他任何系统的恶性肿瘤；③所用组织标本都经病理科专家盲法阅片诊断；④所用标本组织均取自相应患者；⑤相应患者病历资料完整。

患者的年龄：良性卵巢上皮性肿瘤组的年龄为19～71岁，交界性卵巢上皮性肿瘤患者的年龄为27～74岁，上皮性卵巢恶性肿瘤患者组的年龄为23～72岁。临床分期采用国际妇产科联盟2000年制定的标准（EIGO 2000年）进行分期。60例卵巢癌EIGO分期为：Ⅰ期11例、Ⅱ期14例、Ⅲ期20例、Ⅳ期15例。依据WHO标准行组织学的分型，包括：19例浆液性囊腺癌，23例黏液性囊腺癌，18例子宫内膜样癌。病理组织学分级，包括：高分化（G1）组16例，中分化（G2）组14例，低分化（G3）组30例。术中发现有腹水者39例，无腹水者21例；术后病理结果证实的有18例发生淋巴结的转移，42例未发现淋巴结的转移。

1.2 主要试剂鼠抗人CD24单克隆抗体（克隆号：MAB847），R&D Systems，浓缩型，稀释浓度为1∶75，鼠抗人OPN单克隆抗体（克隆号：28h6），R&D Systems，浓缩型，稀释浓度为1∶75。即用型二抗检测试剂盒［A试剂增强剂、B试剂酶标羊抗鼠/（兔）聚合物］。

1.3 免疫组织化学SP法将石蜡切片进行脱蜡、水化及抗原修复，每张切片加入30 m L/L H2O2液，目的是除掉内源性过氧化物酶活性，室温孵育15 min，PBS冲洗3次后，甩去PBS液，每张切片滴加1滴相应的第一抗体（CD24抗体或OPN抗体），4℃冰箱过夜。PBS冲洗3次，甩去PBS液，每张切片滴加1滴聚合物增强剂（试剂A），室温放置15 min。PBS冲洗3次，甩去PBS液，每张切片滴加1滴二抗酶标抗鼠/（兔）聚合物（试剂B），室温放置15 min，PBS冲洗3次，进行DAB显色2～5 min，流水洗至显色停止，苏木素复染脱水透明和中性树胶封片，而后镜下观察。选取肺癌组织CD24/OPN阳性表达作为阳性组的对照。阴性组的对照采用PBS代替CD24/OPN，实验标本严格按照实验要求进行染色，而且染色是在每批中随机抽取进行的。

1.4 结果判断由资深的病理科医生在显微镜下进行双盲阅片。判定标准：每例标本随机选10个高倍镜视野，每视野计数100个细胞，根据选取视野细胞着色强度、阳性细胞百分率结果分析。CD24免疫组化染色阳性信号定位于胞膜和（或）胞质，OPN阳性信号定位于胞核，均呈黄色颗粒，显色强时为棕黄色。按照阳性细胞比例计分，不表达为（-），＜10%计（+），10%～50%计（++），＞50%计（+++）。

1.5 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件进行分析。CD24、OPN在组织中的表达水平用百分率表示，进行χ2检验、Eisher's确切概率法检验。CD24和OPN在卵巢肿瘤组织中表达的相关性研究采用Spearman秩相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 CD24在卵巢上皮性肿瘤组织中的表达CD24蛋白的表达率水平随着正常、良性、交界性和恶性的变化而逐步上升，各组间差异具有统计学意义（表1、图1）。

2.2 CD24蛋白的表达与上皮性卵巢癌临床病理之间的关系CD24蛋白的表达随着卵巢上皮性癌临床分期升高、病理分级降低其阳性表达率逐渐上升。阳性表达率与上皮性卵巢癌的组织学分型无关（表2）。

表1 CD24在不同卵巢组织中的表达Tab.1 The expression of CD24 in different ovary tissues

图1 CD24和OPN在不同卵巢组织中的表达Eig.1 The expression of CD24 and OPN in different ovary tissues

表2 CD24的表达与卵巢癌临床病理之间的关系Tab.2 Relationship between the expression level of CD24 in ovarian cancer and clinicopathological parameters

2.3 OPN在卵巢上皮性肿瘤组织中的表达OPN蛋白的表达率随着正常、良性、交界性和恶性的变化而逐步上升，各组间差异具有统计学意义（表3、图1）。

2.4 OPN蛋白的表达与上皮性卵巢癌临床病理之间的关系随着卵巢上皮性癌的临床分期升高和病理分级降低，OPN的阳性表达率逐渐升高；阳性表达率与上皮性卵巢癌的组织学分型无关（表4）。

2.5 相关性分析采用Spearman等级相关法进行统计学分析，结果提示CD24和OPN在卵巢上皮性癌组织中表达具有相关性（表5）（rs=0.808，P＜0.001）。

3 讨 论

近年发现在肿瘤的侵袭转移过程中CD24作为黏附分子发挥着重要的作用。它参与肿瘤细胞的增殖分化和凋亡，在肿瘤的发生发展和转移中起关键作用。CD24被认为是新的致癌基因和转移促进因子，在多种系统的肿瘤中表达。CD24是高度糖基化的黏蛋白，具有27个氨基酸小片段，经由甘油磷脂酰肌醇与细胞表面连接［1］。研究证实糖基化的CD24是高度变异具有细胞类型依赖性的。CD24有使细胞和细胞间、细胞和基质间粘附的作用，其糖基化作用是作为细胞连接点上分子间相互传递信号的媒体。研究发现CD24广泛表达在多种造血系统肿瘤和实体瘤中［2-5］，并且和肿瘤的侵袭转移、复发和预后密切相关。OPN是一种磷酸化蛋白，具有多种生理病理功能［6］，最早是由SENGER在1979年将其作为一种与恶性肿瘤相关的蛋白提出来的［7］。人OPN结构中有大量丝氨酸与天冬氨酸残基，包含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Glu-Asp，RGD）结构域，这使它与受体的结合增强，进而增强细胞的粘附，在细胞的移行过程中起重要作用。RGD结构还能使OPN对基质金属蛋白酶-2（MMP-2）激活，从而增强肿瘤细胞的侵袭和瘤体的转移［8-10］。OPN可以促进肿瘤细胞的生长和增殖，诱导新生血管的形成，促进肿瘤细胞的黏附和转移以及通过多种途径参与肿瘤的浸润和转移。

表3 OPN在不同卵巢组织中的表达Tab.3 The expression of OPN in different ovary tissues

表4 OPN的表达与卵巢癌的临床病理之间的关系Tab.4 Relationship between the expression level of OPN in ovarian cancer and clinicopathological parameters

表5 CD24与OPN表达的相关性Tab.5 The correlation of the expression levels of CD24 and OPN in ovarian cancer

本实验结果显示，CD24在正常卵巢组织不表达，在良性、交界性、恶性上皮性卵巢组织中的表达逐渐上升；OPN在正常、良性、交界性、恶性上皮性卵巢组织的阳性表达率逐渐上升，且二者在上皮性卵巢癌的阳性表达率明显高于良性及交界性上皮性卵巢肿瘤组织的阳性表达率。随着上皮性卵巢癌的临床分期升高，CD24、OPN蛋白的阳性表达率升高，提示CD24、OPN的高表达与卵巢癌临床分期有关。上皮性卵巢癌病理分级升高，CD24、OPN的阳性表达率降低，提示CD24、OPN的高表达与上皮性卵巢癌的病理分级有关。CD24、OPN表达率与上皮性卵巢癌的组织学分型无关。采用Spearman等级相关法进行统计学分析，结果提示CD24和OPN在卵巢上皮性癌组织中表达具有相关性（rs=0.808，P＜0.001）。

相关研究发现，CD24在乳腺癌、肺癌、前列腺癌、膀胱癌［11-15］等上皮来源的肿瘤组织中呈高表达。相关研究证实侵袭癌患者CD24高表达者生存期明显呈下降。对CD24的表达抑制能够明显降低瘤体细胞的增殖转移与浸润能力。YANG等发现在转移性肝细胞癌组织和肝细胞癌复发的组织中CD24表达明显较高，术后经介入栓塞动脉血管能够使CD24阳性表达的肝细胞癌患者的复发率降低。CD24与Wnt/β-catenin通路的活化有关联。进而说明细胞中CD24的过表达和肿瘤细胞的增殖、侵袭及转移密切有关。实验还提示CD24高表达是肝细胞癌术后不良预后的一个指标。

ROSEN等［16］研究发现OPN与卵巢肿瘤的发生发展有一定关系，在正常的卵巢细胞中表达阴性，在卵巢良性囊腺瘤、交界性卵巢肿瘤与浆液性恶性卵巢肿瘤表达逐渐上升。本研究结果进一步说明OPN可能和卵巢恶性肿瘤发展相关。通过对OPN蛋白在卵巢良、恶性肿瘤中的表达情况和临床各参数之间的关系进行分析研究，提示OPN在卵巢癌的发生进展、复发、转移过程发挥着重要的作用。OPN蛋白对于促进肿瘤发生、发展的作用与肿瘤的组织来源关系不大，这也与我们近年来的研究相一致。

综上所述，本研究发现CD24和OPN在上皮性卵巢癌的恶性生物学行为中起重要作用，其高表达者，卵巢上皮性癌的恶性程度较高，临床预后差，易于发生侵袭、转移，其可作为判断卵巢癌转移和恶性程度的一种生物学指标。根据CD24和OPN在上皮性卵巢癌中的表达规律，及其表达率与卵巢上皮性癌侵袭、转移行为间的关系，可为卵巢癌的诊断治疗和预后评估开辟一条新的途径。二者共同表达可能有协同作用。共同增强细胞黏附，增强瘤体的侵袭和转移。对二者的检测可能更好的预测卵巢上皮性肿瘤的侵袭转移、复发和预后。两者高表达可能预测着术后复发的危险，但二者是否相互协同促进表达，其具体机制仍需进一步研究，探索二者在卵巢上皮性肿瘤的表达及相互关系为监测卵巢癌的发生、发展、复发和预后提供了更广阔的空间和思路。

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（编辑 韩维栋）

Expression of CD24 and OPN in ovarian epithelial tumor and their relationship with invasion metastasis

WANG Xiao-xiao1，2，XING Lan-ying1，ZHONG Hua3，WANG Zhi-rong4，EAN Jiang-bo1
（1.Department of Gynecology and Obstetrics，the Second Affiliated Hospital of Xi'an Jiaotong University Health Science Center，Xi'an 710004；2.Department of Gynecology and Obstetrics，Xi'an No.4 Hospital，Xi'an 710004；3.Xi'an Weiyang Zhengtai Hospital，Xi'an 710016；4.Northwestern Polytechnical University Hospital，Xi'an 710072，China）

Objective To investigate the expression of cluster of differentiation 24（CD24）and osteopontin（OPN）in ovarian epithelial tumor so as to further explore the pathogenesis of ovarian cancer and the effects of high expression of CD24 and OPN on invasion and metastasis in ovarian cancer.Methods Immunohistochemistry was employed to determine the expression of CD24 and OPN in the normal，benign，borderline and ovarian cancer tissues.Results The immunohistochemical results showed the positive expression of CD24 gradually increased with the changes of normal，benign，border and malignant nature in ovarian epithelial tumor.There were significant differences between all the groups（P＜0.05）.The advanced the clinical stage，the higher the expression rate.The higher the pathological classification，the lower the expression rate.CD24 protein expression did not have histological specificity.The positive expression of OPN gradually increased with the changes of normal，benign，border and malignant nature in ovarian epithelial tumor.All the groups differed significantly（P＜0.05）.The more advanced the clinical stage，the higher the expression rate.The higher the pathological classification，the lower the expression rate.OPN protein expression had no histological specificity.The positive rate of CD24 and OPN expression was positively correlated in ovarian epithelial tumor（P＜0.05）.Conclusion The high expression of CD24 and OPN protein plays an important role in the occurrence，development，invasion and metastasis of ovarian tumor.The expression of CD24 and OPN can predict the progression，prognosis and recurrence risk of ovarian cancer.

ovarian tumor；cluster of differentiation 24（CD24）；osteopontin（OPN）；immunocytochemistry；metastasis

R711.75

A

10.7652/jdyxb201505019

2014-07-08

2014-11-28

陕西省社会发展科技攻关项目（No.2015SE117）Supported by the Social Pevelopment Research Project of Shaanxi Province（No.2015SE117）

邢兰瑛.E-mail：Eang990@people.com.cn

优先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150515.0950.005.html（2015-05-15）