低氧诱导肾上腺髓质素对卵巢癌细胞及在体肿瘤的生长促进作用

周美芳，陈丽萍，吕杰强

（1.温州医科大学附属第二医院妇产科，浙江温州 325000；2.温州市中西结合医院妇产科，浙江温州 325000）

低氧诱导肾上腺髓质素对卵巢癌细胞及在体肿瘤的生长促进作用

周美芳1，2，陈丽萍2，吕杰强1

（1.温州医科大学附属第二医院妇产科，浙江温州 325000；2.温州市中西结合医院妇产科，浙江温州 325000）

目的 观察低氧情况下肾上腺髓质素（ADM）对卵巢癌细胞及在体肿瘤的生长促进作用。方法 三种卵巢癌细胞系A2780、SKOV3、HO-8910于低氧环境中培养6～24 h，采用RT-PCR分析ADM、低氧诱导因子1α（HIE-1α）、血管内皮生长因子（VEGE）的mRNA表达改变。通过质粒转染获得稳定表达ADM-shRNA的HO-8910细胞，流式细胞术检测ADM表达沉默后卵巢癌细胞的细胞凋亡比例。建立卵巢癌细胞裸鼠荷瘤模型，各组裸鼠每天腹腔内注射5 mg/kg的顺铂或皮下瘤内注射10μg/kg的ADM-shRNA，观察肿瘤体积变化并采用Western blot检测ADM蛋白表达。结果 HO-8910细胞24 h低氧使ADM mRNA表达上升4.13倍（P＜0.000 1），VEGE、HIE-1α的mRNA表达则比对照组升高3.46（P＜0.01）和3.91倍（P＜0.000 1）。转染72 h后，sh ADM组细胞ADM蛋白表达量比对照组降低48.2%（P＜0.05），mRNA比对照组降低26.9%（P＜0.000 1）。sh ADM组凋亡细胞比例显著高于正常组（sh ADM组：42.65%；正常组：8.4%；二者相比P＜0.01）。顺铂+sh ADM组的抑瘤率为71.39%，显著高于顺铂+ PBS组的39.21%（P＜0.001）或者盐水+sh ADM组的49.45%（P＜0.05）。结论 低氧环境可诱导卵巢癌细胞ADM表达增加，激活VEGE和HIE-1相关信号通路，继而促进卵巢癌细胞的生长存活。ADM基因沉默能显著促进卵巢癌细胞凋亡并加强顺铂对裸鼠在体瘤的抑瘤作用，因此可能成为卵巢癌基因治疗的潜在的靶点。

肾上腺髓质素；卵巢癌；顺铂；凋亡

肾上腺髓质素（adrenomedullin，ADM）是血管生成肽家族的一个重要成员，最初从人嗜铬细胞瘤中分离而得来［1］。研究发现，ADM在细胞分裂及细胞在缺氧环境中存活具有作用［2］。ADM通过诱导细胞增殖、抑制细胞凋亡和通过激活多种信号途径调控促癌基因的表达，如低氧诱导因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIE-1）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGE）等，继而在肿瘤的发生和发展中起重要作用。ADM蛋白的过表达被认为与多种肿瘤的发生发展有密切关系。例如，最近有研究报道，在肝细胞癌［3］、前列腺癌［4］、宫颈癌［5］、卵巢癌［6］等多种肿瘤中表达异常。因此，ADM可能是一种重要的促肿瘤增殖及肿瘤细胞凋亡抑制因子，同时研究ADM的作用机制为肿瘤的基因治疗提供了潜在的靶点。从对ADM蛋白表达进行RNA干涉的实验手段为切入点，我们对ADM在3种卵巢癌细胞系中的表达进行了研究，并观察了ADM基因沉默结合传统抗癌药物顺铂对在体肿瘤的生长抑制作用。

1 材料与方法

1.1 材料卵巢癌细胞系A2780、SKOV3、HO-8910购自美国ATCC公司。上述细胞培养于RPMI-1640培养基中并添加150 g/L小牛血清蛋白，设定细胞培养箱培养环境为200 m L/L O2，50 m L/L CO2，37℃恒温。实验动物为BALB/c-nu裸鼠，4～6周龄，体质量为20～22 g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，在动物实验中遵循动物实验伦理原则。单克隆兔抗ADM、抗GAPDH抗体购自Abcam公司。人ADM-shRNA质粒、非靶向性对照质粒（NC-sh RNA）、抗VEGE和抗HIE-1抗体购自Santa Cruz公司。其他药品均购自Sigma-Aldrich公司。

1.2 卵巢癌细胞的低氧诱导卵巢癌细胞A2780、SKOV3、HO-8910培养至对数生长期，每种细胞分为四组接种于6孔板：①低氧6 h组，②低氧12 h组，③低氧24 h组，④正常对照组。每一组均包括三个复孔。实验开始时，低氧24 h组首先暴露于低氧环境中（设定培养箱环境为：10 m L/L O2，50 m L/L CO2，940 m L/L N2，恒温37℃），随后分别于12 h和18 h后培养箱中依次放入低氧12 h组和低氧6 h组以诱导低氧状态。正常对照组细胞则同时在正常培养环境中进行培养。培养结束后所有细胞经胰蛋白酶消化，提取总蛋白及总RNA以进行进一步分析测定。

1.3 质粒转染HO-8910细胞稳定传代后接种于6孔板（密度约每孔1×105个细胞），依照产品说明进行人ADM-sh RNA质粒及NC-sh RNA转染各组细胞。同时采用可表达绿色荧光蛋白的cop GEP质粒进行转染以监测转染效率。质粒转染72 h后，培养基中加入7.0μg/m L嘌呤霉素对细胞进行筛选，筛选后的A2780细胞内稳定表达ADM-sh RNA。

1.4 裸鼠成瘤实验选取生长良好的HO-8910卵巢癌细胞持续培养48 h，达到90%以上融合度时，常规胰酶消化制成单细胞悬液，调整细胞密度为2.5× 107/m L。裸鼠在超净生物层流架内常规消毒后，背侧皮下注射0.2 m L细胞悬液，每组注射6只。接种肿瘤细胞后，将裸鼠送回笼罩自由摄取食料及水，每天观察小鼠的饮食、精神、二便等一般状况并称重，连续观察3周。接种1周左右，可见接种部位皮下长出米粒大小的硬结，为移植瘤模型建成。

待皮下肿瘤成瘤后，裸鼠随机分为6组（每组n =6），分别为：①盐水+PBS组、②盐水+NC-sh RNA组、③盐水+sh ADM组、④顺铂+PBS组、⑤顺铂+ NC-shRNA组、⑥顺铂+sh ADM组。各组裸鼠每天腹腔内注射5 mg/kg的顺铂或皮下肿瘤内注射10 μg/kg的ADM-shRNA。对照组分别腹腔注射等体积盐水、皮下肿瘤内注射PBS或NC-sh RNA作为对照。每隔3 d用游标卡尺测量肿瘤结节的长径（A）、短径（B），按公式“体积=（A×B2）/2”计算出肿瘤近似体积。连续观察28 d，根据计算所得的肿瘤体积绘制肿瘤移植瘤生长曲线并计算肿瘤抑制率。实验结束时采用拉颈处死，解剖取出肿瘤组织，称重后分两份保存，以备提取蛋白、RNA，进行后续分析之用。

1.5 Western blot分析收集待检细胞或组织样本放入离心管中，加入预冷的RIPA组织裂解液（含磷酸酶抑制剂及蛋白酶抑制剂）进行充分裂解（组织样本进行匀浆），将裂解物依次进行变性、离心。将蛋白加样到SDS-PAGE凝胶中电泳。电泳后半干法转移到PVDE膜上，100 m L/L脱脂牛奶室温封闭1 h，分别加入抗ADM、抗VEGE、抗HIE1α和抗GAPDH抗体（抗体稀释浓度均为1∶1 000），4℃孵育过夜。TBST洗膜后再用相应的HRP标记的二抗室温孵育1 h。洗膜后ECL化学发光，Quantity One凝胶图像处理系统（美国伯乐公司）照相并分析目标带的分子量。每组实验均重复3次。

1.6 逆转录聚合酶链反应收集待检细胞或组织样本，采用RNAiso Plus Kit试剂盒（Ta KaRa公司）提取总RNA，乙醇干燥后，将所得RNA溶于无RN酶纯水中，紫外分光光度计定量。PrimeScript RT Kit试剂盒（Ta KaRa公司）对总RNA进行逆转录反应，cDNA合成反应条件（20μL体系）如下：1.0μg总RNA，加入4.0μL 5×PrimeScript Buffer，1.0μL Oligod T Primer，1.0μL PrimeScript RT Enzyme MixⅠ，1.0μL Random 6mers，加RNase Eree d H2O至终体积20μL，于37℃反应15 min，85℃反应5 s。实时PCR反应使用伯乐公司IQ5荧光定量PCR仪进行检测，反应体系为25μL，其中逆转录产物（cDNA模板）2.0μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）12.5μL，引物各1.0μL，加入去离子水至终体积25 μL，放置于PCR仪扩增。PCR反应条件如下：预变性为95℃30 s一个循环；PCR扩增程序为95℃变性5 s，65℃退火延伸30 s，40次循环；溶解曲线检测PCR产物特异性，分析条件为95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，温度间隔0.5℃/s。各扩增基因引物序列如下：ADM上游引物5＇-ACTTGGCAGATCACTCTCTTAGCA-3＇，下游引物5＇-ATCAGGGCGACGGAAACC-3＇；VEGE上游引物5＇-GCACCCATGGCAGAAGG-3＇，下游引物5＇-GGGGTACCCCTCACCGCCTCGGCTTGTC-3＇；HIE-1α上游引5＇-GAAAGCGCAAGTCCTCAAAG-3＇，下游引物5＇-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3＇；GAPDH上游引物5＇-CAAATTCCATGGCACCGTC-3＇，下游引物5＇-CCCATCTGATTTTGGAGGGA-3＇。采用比较Ct值法分析各实验组与对照组之间目的基因扩增的相对变化，通过根据公式Eolds=2-△△Ct计算各检测目的基因相对于GAPDH的相对表达量。其中△△Ct=实验组（Ct目的基因-CtGAPDH）-对照组（Ct目的基因-CtGAPDH）。每组实验均重复3次。

1.7 细胞凋亡检测收集细胞样本，用胰酶消化成单细胞悬液，PBS冲洗两次，1 000 r/min离心5 min。加入结合缓冲液200μL重悬细胞，加入10μL PI溶液（20μg/m L）和5μL Annexin V混匀后室温避光染色15 min后上EACSCalibur流式细胞仪检测。将Annexin V染色阳性而PI染色阴性的细胞判定为凋亡细胞。

1.8 统计学处理采用统计软件包GraphPad Prism 5.0对数据进行处理，实验结果用均数±标准差表示。各组之间用单因素方差分析（对在体肿瘤生长体积结果使用双因素方差分析）和Dunnet-t检验进行数据的处理和比较，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 低氧诱导的卵巢癌细胞ADM、VEGF、HIF-1α的mRNA表达情况RT-PCR结果发现低氧环境下（图1），在A2780卵巢癌细胞中ADM的m RNA表达随低氧时间的增加而出现显著增高（E（3，8）= 9.054，P=0.006 7）。其中，24 h低氧组ADM的mRNA表达量比对照组升高3.72倍（P＜0.000 1）。而VEGE、HIE-1α的mRNA表达量同样随低氧时间延长而出现不同程度的升高（VEGE：E（3，8）=5.370，P=0.036 4；HIE-1α：E（3，8）=7.288，P=0.029 7）。在SKOV3细胞系中，单因素方差分析结果发现低氧环境对ADM、VEGE、HIE-1α的表达都有显著影响（ADM：E（3，8）=26.018，P=0.006 5；VEGE：E（3，8）= 10.661，P=0.008 7；HIE-1α：E（3，8）=49.9，P＜0.000 1）。在HO-8910细胞系，低氧环境下ADM、VEGE、HIE-1α的表达同样显著增高（ADM：E（3，8）= 11.51，P=0.0096；VEGE：E（3，8）=4.304，P=0.041 2；HIE-1α：E（3，8）=11.7，P=0.008 7）。多重比较发现，24 h低氧使ADM mRNA表达上升4.13倍（P＜0.000 1）。与之相对应，VEGE、HIE-1α的表达则比对照组升高3.46（P=0.007 9）和3.91倍（P＜0.000 1）。以上结果表明，低氧能使卵巢癌细胞中ADM高表达，并诱导促癌基因VEGE、HIE-1α的表达增高。

2.2 ADM基因沉默对卵巢癌细胞凋亡的影响卵巢癌细胞HO-8910进行质粒转染后，经流式细胞术检测转染效率达到87.1%，转染效率较高。转染72 h后对转染细胞进行蛋白及mRNA表达分析（图2A），sh ADM组细胞的ADM表达量比对照组降低48.2%（P=0.054 4），mRNA比对照组降低26.9%（P＜0.000 1），而NC-shRNA组ADM蛋白及mRNA表达与正常对照组无差异。这表明通过转染ADM-shRNA成功沉默了ADM在细胞中的表达。流式细胞术检测各组细胞凋亡情况，结果如图2B所示。稳定表达ADM-shRNA的HO-8910细胞其凋亡细胞比例显著高于正常组（sh ADM组：42.65%；正常组：8.4%；二者相比P=0.003 1）。而NC-sh RNA组与正常组相比无显著性差异（NC-sh RNA组：12.2%；二者相比P=0.461）。表明ADM基因沉默可显著促进卵巢癌细胞凋亡。

图1 低氧环境下卵巢癌细胞ADM、VEGF、HIF-1α的mRNA表达Eig.1 ADM，VEGE and HIE-1αmRNA expressions in ovarian cancer cells under hypoxia condition

2.3 ADM基因沉默对卵巢癌在体肿瘤生长的影响裸鼠荷瘤7 d后，每天腹腔给予顺铂或皮下肿瘤内注射ADM-sh RNA，连续21 d。其中，盐水+PBS为空白对照组，盐水+NC-sh RNA为质粒转染阴性对照组，盐水+sh ADM为ADM m RNA干扰组，顺铂+ PBS为顺铂治疗组，顺铂+NC-sh RNA为顺铂合并质粒转染阴性对照组，而顺铂+sh ADM则为顺铂合并sh ADM联合治疗组。各组裸鼠肿瘤近似生长体积如图3A所示。各组裸鼠在实验结束时（第28天）的肿瘤体积、肿瘤抑制率见表1。

表1 荷瘤28 d后各组裸鼠的肿瘤体积和肿瘤抑制率Tab.1 The tumor volume and tumor inhibition rate of nude mice 28 d after tumor xenograft（n=6）

结果表明与空白对照组相比，腹腔注射顺铂的各组裸鼠肿瘤体积有明显减小。而顺铂+sh ADM组的抑瘤率高达71.39%，显著高于顺铂治疗组的39.21%或单纯ADM mRNA干扰组的49.45%（P=0.0347）。双因素方差分析肿瘤组织内的ADM蛋白表达量（图3B），结果表明腹腔注射顺铂（E1，30=8.37，P=0.005 7）和瘤内注射ADM-shRNA（E2，30=27.59，P＜0.000 1）对肿瘤生长都具有一定抑制作用。此外，顺铂和ADM-sh RNA还具有显著的交互作用（E2，30=0.66，P= 0.046 6）。多重检验表明，ADM干扰组的ADM蛋白表达显著低于空白组（P=0.008 7），顺铂+ sh ADM组的ADM蛋白表达显著低于顺铂治疗组（P＜0.000 1）。此外，顺铂+sh ADM组与盐水+ sh ADM组的ADM蛋白表达量相比没有显著性差异（P=0.421 4）。以上结果表明，顺铂与ADM基因沉默对裸鼠在体瘤具有显著的协同抑瘤作用。

3 讨 论

卵巢癌是发生于卵巢组织的恶性肿瘤，起病隐匿、易转移，占所有妇科恶性肿瘤的15%左右，由于其发展迅速、易复发、化疗耐药，患者5年存活率仅有30%左右［7］。因此，探索新的诊断和治疗靶点具有十分重要的意义。

图2 ADM基因沉默对卵巢癌细胞凋亡的影响Eig.2 The effect of ADM silencing on apoptosis of ovarian cancer cells

图3 ADM基因沉默在裸鼠荷瘤实验中的作用Eig.3 The effect of ADM gene silencing on tumor growth in vivo

ADM具有广泛的生理调节功能。JI等［8］报道，ADM通过增加c AMP和c-fos表达，能够促进细胞有丝分裂。ADM也在许多的肿瘤中广泛表达，提示它可能是一个重要的肿瘤生长因子，并且可促进肿瘤血管生成。CUTTITTA等［9］探索了ADM和其受体在肺癌细胞系的表达情况，认为ADM可能是肿瘤细胞的自分泌或旁分泌生长因子，且对于不同类型的肿瘤细胞增殖有着不同的影响。本实验在缺氧的条件下培养A2780、SKOV3、HO-8910三种卵巢癌细胞，在不同的缺氧诱导时间点（0～24 h）使用RT-PCR检测ADM m RNA的表达情况。结果发现相对于常氧条件下，缺氧诱导能诱导各组细胞ADM表达加强。A2780与HO-8910细胞在缺氧诱导6 h后ADM的表达即有明显增高，且随着缺氧时间的延长，ADM的表达与缺氧诱导的时间呈正相关关系。ADM基因敲除小鼠在生长过程中出现血管发育异常［10］，相比于野生型小鼠的血管发育情况，ADM基因敲除小鼠的末端组织血液灌注水平低，侧支循环网交通不充分，组织内血氧分压低，表明ADM是必不可少的血管形态发生因子。此外，有研究发现肿瘤细胞低氧环境可导致ADM过表达［11］。以上的证据进一步支持了本实验的结果，提示组织缺氧状态有可能刺激肿瘤细胞过度产生和分泌ADM，从而实现肿瘤细胞在低氧状态下的自我保护。

在本实验中还观察到ADM的表达改变伴随了VEGE、HIE-1基因的表达升高。卵巢癌是一种多血管实体瘤，随着肿瘤体积增加及卵巢癌细胞的增生、侵袭转移，大量肿瘤细胞由于新血管生成不足和血液循环不佳而经常处于慢性低氧状态下，因此缺氧被认为在卵巢癌的发生发展中具有重要作用［12］。大量研究表明，微环境缺氧可以促进肿瘤细胞增殖及特定促癌基因的表达（如HIE-1、VEGE）［13］，往往预示着肿瘤化疗抵抗及预后不良［14］。在微环境慢性低氧时，肿瘤细胞可以通过转录调控机制提高HIE-1和VEGE的表达，继而激活糖酵解系统、血管发生系统、细胞周期调控系统重要基因的表达，最终促进细胞存活［15］。HIE-1α可与缺氧反应原件（hypoxia responsive element，HRE）共同结合与许多基因的启动子区，调控如促血管生成基因VEGE等基因转录活性［16］。VEGE是一种旁泌生长因子，其可以结合于邻近细胞表面的VEGE受体上激活细胞内细胞外调节蛋白激酶、糖原合成酶激酶-3等信号通路，促进血管内皮细胞分裂生长形成新血管，为肿瘤生长提供条件［17］。此外，还有证据表明ADM可以部分介导VEGE和HIE-1相关信号通路的激活［18-19］。我们的结果发现A2780、SKOV3、HO-8910三种卵巢癌细胞中，HO-8910对12～24 h的低氧更为敏感，因而我们选择使用该细胞进行质粒转染并培养稳定表达ADM-shRNA的细胞。

证据表明ADM具有调控细胞凋亡的作用，其具体效应依细胞种类及实验条件的变化而有所不同［20］。在肝癌细胞中，ADM可上调c AMP并激活丝裂原激活的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）来调控凋亡基因表达［3］。NIKITENKO等［2］发现ADM可上调Bcl-2并激活原癌基因如Ras、Raf、蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）等，从而抑制细胞凋亡。我们的实验结果发现，ADM基因沉默的卵巢癌细胞凋亡率显著高对照组，说明干扰ADM的表达可显著促进卵巢癌细胞凋亡，提示我们ADM可能是一个重要的肿瘤生长因子。然而，在卵巢癌中ADM调控作用的确切分子机制目前尚未阐明。本实验结果表明，ADM信号通路能够促进卵巢癌细胞生长、抑制凋亡，此外，我们采用裸鼠荷瘤模型瘤内注射ADM-shRNA结合腹腔给予顺铂来观察肿瘤体积变化，发现ADM基因沉默显著加强了顺铂对裸鼠在体瘤的抑瘤作用。

未来肿瘤治疗的理想的方法是针对某一特定来源、特定病理类型的肿瘤，都有其个体化的治疗方法和作用靶点。本实验结果表明，ADM在人卵巢癌细胞中呈阳性表达，且在缺氧条件下进一步表达上调并激活VEGE和HIE-1信号通路，继而促进卵巢癌细胞的生长存活。ADM基因沉默能显著促进卵巢癌细胞凋亡并加强顺铂对裸鼠在体瘤的抑瘤作用。因此，ADM可能成为卵巢癌肿瘤基因治疗的潜在的靶点。利用RNA干涉技术如能有效抑制ADM表达并对细胞生长进行调控，同时结合化疗药物进行治疗，将有可能是一种更为高效、特异的卵巢癌治疗方案。总之，ADM作为一种促肿瘤细胞生长因子，值得进一步深入研究。

［1］KITAMURA K，KANGAWA K，KAWAMOTO M，et al.Adrenomedullin：a novel hypotensive peptide isolated from human pheochromocytoma 1993［J］.Biochem Biophys Res Commun，2012，425（3）：548-555.

［2］NIKITENKO LL，FOX SB，KEHOE S，et al.Adrenomedullin and tumour angiogenesis［J］.Br J Cancer，2006，94（1）：1-7.

［3］PARK SC，YOON JH，LEE JH，et al.Hypoxia-inducible adrenomedullin accelerates hepatocellular carcinoma cell growth［J］.Cancer Lett，2008，271（2）：314-322.

［4］JIMENEZ N，ABASOLO I，JONGSMA J，et al.Androgen-independent expression of adrenomedullin and peptidylglycine alpha-amidating monooxygenase in human prostatic carcinoma［J］.Mol Carcinog，2003，38（1）：14-24.

［5］LI Z，TAKEUCHI S，OTANI T，et al.Implications of adrenomedullin expression in the invasion of squamous cell carcinoma of the uterine cervix［J］.Int J Clin Oncol，2001，6（6）：263-270.

［6］LIU J，BUTZOW R，HYDEN-GRANSKOG C，et al.Expression of adrenomedullin in human ovaries，ovarian sex cord-stromal tumors and cultured granulosa-luteal cells［J］.Gynecol Endocrinol，2009，25（2）：96-103.

［7］RUSTIN G，VAN DER BURG M，GRIFFIN C，et al.Early versus delayed treatment of relapsed ovarian cancer［J］.Lancet，2011，377（9763）：380-381.

［8］JI SM，WANG ZM，LI XP，et al.Intracerebroventricular administration of adrenomedullin increases the expression of c-fos and activates nitric oxide-producing neurons in rat cardiovascular related brain nuclei［J］.Acta Physiologica Sinica，2004，56（3）：328-334.

［9］ZUDAIRE E，MARTINEZ A，GARAYOA M，et al.Adrenomedullin is a cross-talk molecule that regulates tumor andmast cell function during human carcinogenesis［J］.Am J Pathol，2006，168（1）：280-291.

［10］ICHIKAWA-SHINDO Y，SAKURAI T，KAMIYOSHI A，et al.The GPCR modulator protein RAMP2 is essential for angiogenesis and vascular integrity［J］.J Clin Investig，2008，118（1）：29-39.

［11］LARRAYOZ IM，MARTINEZ-HERRERO S，GARCIASANMARTIN J，et al.Adrenomedullin and tumour microenvironment［J］.J Transl Med，2014，12（1）：339.

［12］JI F，WANG Y，QIU L，et al.Hypoxia inducible factor 1alphamediated LOX expression correlates with migration and invasion in epithelial ovarian cancer［J］.Int J Oncol，2013，42（5）：1578-1588.

［13］YU SJ，YOON JH，LEE JH，et al.Inhibition of hypoxia-inducible carbonic anhydrase-Ⅸenhances hexokinaseⅡinhibitor-induced hepatocellular carcinoma cell apoptosis［J］.Acta Pharmacol Sin，2011，32（7）：912-920.

［14］DAYAN F，MAZURE N M，BRAHIMI-HORN MC，et al.A dialogue between the hypoxia-inducible factor and the tumor microenvironment［J］.Cancer Microenviron，2008，1（1）：53-68.

［15］LIANG J，ZHANG Z，LIANG L，et al.HIF-1 alpha regulated tongue squamous cell carcinoma cell growth via regulating VEGF expression in a xenograft model［J］.Ann Transl Med，2014，2（9）：92.

［16］POSTOVIT LM，ABBOTT DE，PAYNE SL，et al.Hypoxia/ reoxygenation：a dynamic regulator of lysyl oxidase-facilitated breast cancer migration［J］.J Cell Biochem，2008，103（5）：1369-1378.

［17］CHOI HJ，ARMAIZ PENA GN，PRADEEP S，et al.Antivascular therapies in ovarian cancer：moving beyond anti-VEGF approaches［J］.Cancer Metastasis Rev，2015，34（1）：19-40.

［18］OLADIPUPO S，HU S，KOVALSKI J，et al.VEGF is essential for hypoxia-inducible factor-mediated neovascularization but dispensable for endothelial sprouting［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（32）：13264-13269.

［19］SUN W，DEPPING R，JELKMANN W.Interleukin-1 beta promotes hypoxia-induced apoptosis of glioblastoma cells by inhibiting hypoxia-inducible factor-1 mediated adrenomedullin production［J］.Cell Death Dis，2014，5：e1020.

［20］LIU AG，ZHANG XZ，LI FB，et al.RNA interference targeting adrenomedullin induces apoptosis and reduces the growth of human bladder urothelial cell carcinoma［J］.Med Oncol，2013，30（3）：616.

（编辑 韩维栋）

Hypoxia-induced adrenomedullin promotes the growth of ovarian cancer cells and hetero-grafted ovarian tumor in vivo

ZHOU Mei-fang1，2，CHEN Li-ping2，LÜJie-qiang1
（1.Department of Obstetrics and Gynecology，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000；2.Department of Obstetrics and Gynecology，the Chinese and Western Medicine Integration Hospital of Wenzhou，Wenzhou 325000，China）

Objective To observe the growth-promoting effect of adrenomedullin（ADM）on the ovarian cancer cells growth under hypoxia condition and heter-grafted tumor growth in vivo.Methods Three ovarian cancer cell lines，A2780，SKOV3 and HO-8910 cells，were incubated for 6 h to 24 h under hypoxia condition.The mRNA expressions of ADM，hypoxia-inducible factor-1α（HIF-1α），and vascular endothelial growth factor（VEGF）were analyzed by RT-PCR.Stable ADM-sh RNA expressing HO-8910 cells was obtained by plasmid transfection. The apoptosis rate of ovarian cancer cells was analyzed by flow cytomertry after ADM gene silence.Tumor-bearing model of ovarian cancer HO-8910 cells was established in nude mice.These mice were intraperitoneally injected with 5 mg/kg of cisplatin or subcutaneously injected with 10μg/kg of ADM-sh RNA plasmid each day.The tumor volume was measured and ADM protein expression was analyzed by Western blot.Results In HO-8910 cells under hypoxia condition for 24 h，ADM m RNA expression increased 4.13 times（P＜0.000 1），the expressions of VEGF and alpha HIF-1αwere 3.46 times（P＜0.01）and 3.91（P＜0.000 1）times higher than those in the control group，respectively.At 72 h after the transfection，ADM protein expression was 48.2%lower（P＜0.05）and mRNAexpression was 26.9%lower（P＜0.000 1）in sh ADM group compared with the control group.There was no difference between NC-sh RNA group and control group in ADM protein or mRNA expression.The apoptosis ratio in sh ADM cells was significantly higher than that in the normal group（sh ADM groups：42.65%；normal group：8.4%；P＜0.01）.The tumor inhibition rate in cisplatin+sh ADM group was 71.39%，significantly higher than that of cisplatin alone group（39.21%，P＜0.001）or sh ADM group（49.45%，P＜0.05）.Conclusion Hypoxia could induce increased ADM expression，activate VEGF and HIF-1 signal pathways，and thus promote the growth of ovarian cancer cells.ADM gene silencing can significantly strengthen the tumor-suppressive effect of cisplatin in nude mice in vivo.The ADM gene intervention may be a potential target for ovarian tumor gene therapy in the future.

adrenomedullin；ovarian cancer；cisplatin；apoptosis

R711；R737

A

10.7652/jdyxb201505013

2014-12-01

2015-01-17

浙江省重点科技创新团队项目（No.2012162）Supported by the Key Program of Innovational Technology of Zhejiang Provience（No.2012162）

吕杰强.E-mail：jieqianglu@126.com

优先出版：http：//www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20150721.0841.002.html（2015-07-21）