黑龙江省萤蔺对苄嘧磺隆和吡嘧磺隆抗性测定

刘亚光，李敏，李威，朱金文，刘蓝坤，师慧（.东北农业大学农学院，哈尔滨50030；.浙江大学农业与生物技术学院，农业部作物病虫分子生物学重点开放实验室，杭州3009）

黑龙江省萤蔺对苄嘧磺隆和吡嘧磺隆抗性测定

刘亚光1，李敏1，李威1，朱金文2，刘蓝坤1，师慧1
（1.东北农业大学农学院，哈尔滨150030；2.浙江大学农业与生物技术学院，农业部作物病虫分子生物学重点开放实验室，杭州310029）

我国是世界最大水稻生产国，水稻在我国粮食生产中占有重要地位[1]。黑龙江省又是我国重要水稻生产基地，确保黑龙江省水稻高产稳产对我国粮食安全具有重要意义。稻田杂草是影响水稻产量重要因素之一，据统计，我国常年受杂草危害农作物面积高达9 000多万hm2，严重危害面积约4 500万hm2，现有防治水平下，由杂草危害造成的直接经济损失每年高达900多亿元[2]。萤蔺是水田常见难防除杂草之一，危害较重，分布范围广，除内蒙古、甘肃、西藏外，其他省区均有分布，难以清除[3]。为克服人工除草效率低、劳动强度大等缺点，化学除草应运而生。但是，长期过度使用除草剂导致抗药性杂草发生，除草剂药效下降，致使农田草害加剧，防除难度增大。据报道，当抗药性杂草种群密度超过50%时，作物产量损失率可高达50%～90%[4]。

磺酰脲类除草剂是水稻田常用除草剂，其中以苄嘧磺隆和吡嘧磺隆使用居多[5]。近年来，有报道称苄嘧磺隆和吡嘧磺隆对杂草防除效果有所下降，虽然不断增加用药量，但对杂草防效仍不明显。目前，黑龙江省部分地区萤蔺危害十分严重，但该杂草对苄嘧磺隆、吡嘧磺隆是否产生抗性以及抗性水平国内未见报道。为此，本研究以采自黑龙江省6个地区水稻田主要莎草科杂草萤蔺为试验材料，初步研究其对苄嘧磺隆和吡嘧磺隆抗性水平，以期为黑龙江省稻田萤蔺防除、抗药性萤蔺检测以及预防抗药性萤蔺发生提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试药剂和仪器

30%苄嘧磺隆可湿性粉剂，上海杜邦农化有限公司生产；10%吡嘧磺隆可湿性粉剂，日本化学工业株式会社生产；微量移液器（Gilson公司）；人工气候箱RXZ（宁波江南仪器厂）。

1.1.2 供试种子

供试萤蔺种子在黑龙江省牡丹江市东京城镇（种群牡01、牡02、牡04）、五常市志广乡（种群五01、五02、五03…五12）、哈尔滨市通河县（种群通河）、哈尔滨市平山镇（种群平山）、肇东市涝洲镇（种群涝洲）、肇东市五站镇（种群五站）按田块区分采集，采用五点取样法采集足量成熟种子，晾干后装入纸袋，常温贮存待用。

1.2 方法

1.2.1 琼脂法测定萤蔺对两种除草剂敏感性

选取籽粒饱满、大小一致萤蔺种子于5℃低温层积处理4周解除休眠，然后30℃光照12 h、15℃黑暗12 h，相对湿度（80±5）%条件下培养，选取刚露白种子试验。

在预备试验基础上，分别配制两种除草剂浓度梯度药液（见表1）。将药剂与6‰琼脂液混匀倒入口径和高分别为6和9 cm的塑料，冷却后备用，并设不加药剂琼脂液为对照，每个种群选择刚萌发10粒萤蔺种子接种于各处理琼脂表面，设3次重复，杯口用保鲜膜覆盖保持湿润，置于光照培养箱中培养（L/D=12 h/12 h，白天/夜晚：30℃/ 26℃），处理后72 h测量芽长，计算IC50，根据IC50明确敏感性和抗性种群。

表1 琼脂法药液浓度Table 1 Application dose ofdifferentherbicides in agar method

1.2.2 利用整株法测定萤蔺对两种除草剂敏感性

将未使用过除草剂、风干过筛的土壤装入直径28 cm、高19 cm塑料桶，浇足底水，耙平土壤表面，每桶播种20粒萤蔺种子，再覆盖1 cm厚过筛风干土，播种后1 d，用喷壶慢慢浇水并保持4 cm左右水层，设置两种除草剂浓度梯度药液（见表2），于水层浑浊状态时用注射器定量抽取药液均匀分散滴入，置于室外正常水分管理。设3次重复，以清水处理为对照，30 d后剪取地上部分，称量鲜重，计算鲜重抑制率，以鲜重抑制率几率（y）和浓度对数值（x）建立毒力回归方程（y=b x+a），求出抑制中剂量（ED50）和抗性指数。

表2 整株法药液浓度Table 2 Application dose of different herbicides in the whole plantmethod

1.3 数据处理

将IC50（ED50）最小萤蔺生物型定为敏感种群，其他萤蔺种群IC50（ED50）与之对比，根据抗性指数=抗性种群IC50/敏感种群IC50，计算抗性指数（RI），RI越大表示该种群抗性越强[6-7]。

抗性水平评价参考文献[8-9]。当RI＜3时，处于敏感阶段；RI在3～5时，为敏感性下降阶段；RI在5～10时，处于低水平抗性阶段；RI在10～40时，为中等水平抗性阶段；RI在40～160时，处于高水平抗性阶段；RI＞160时，处于极高水平抗性阶段。

2 结果与分析

2.1 萤蔺对苄嘧磺隆敏感性测定结果

2.1.1 琼脂法测定结果

由表3可知，平山种群对苄嘧磺隆表现最为敏感，IC50为94.2244 mg·L-1，因此将其设为敏感种群，得出其他种群抗性指数。其中，五07、通河、牡04、五04、五03种群抗性指数分别为14.24、12.77、11.25、10.57、10.26，产生中等水平抗性；涝洲、牡02、五01、五06、五02、五11种群抗性指数分别为5.25、5.84、5.90、6.74、8.66、9.39，产生低水平抗性；五05等5个种群抗性指数在3～5，处于敏感性下降阶段；平山等3个种群抗性指数＜3，处于敏感阶段。

2.1.2 整株法测定结果

由表4可知，五站种群对苄嘧磺隆表现最为敏感，ED50为154.0987 g·hm-2，将其设为敏感种群，得出其他种群抗性指数。五07和通河种群抗性指数分别为11.72、10.36，产生中等抗性水平；五04、五08、牡04种群抗性指数分别为9.82、6.18、5.40，产生低水平抗性；五03等5个种群抗性指数介于3～5，处于敏感性下降阶段；五站等9个种群抗性指数小于3，处于敏感阶段。

表3 萤蔺对苄嘧磺隆敏感性测定结果(琼脂法)Table 3 Susceptibility test of differentbiotypes of Scirpus juncoides Roxb to bensulfuron-methyl(Agar method)

表4 萤蔺对苄嘧磺隆敏感性测定结果(整株法)Table 4 Susceptibility testof differentbiotypes of Scirpus juncoides Roxb to bensulfuron-methyl(Whole plantmethod)

2.1.3 两种方法测定萤蔺对苄嘧磺隆敏感性比较

结果见图1。

由图1可知，在苄嘧磺隆处理下，利用琼脂法和整株法测定五07种群和通河种群抗性水平较高，五07种群抗性指数分别为14.24和11.72，通河种群抗性指数分别为12.77和10.36，处于中等抗性水平，牡02种群抗性指数分别为5.84和4.36，五12种群抗性指数分别为1.33和1.15，处于敏感阶段，利用琼脂法和整株法测定结果趋势相一致，供试其他种群大多符合这一规律。

图1 两种方法测定萤蔺对苄嘧磺隆抗性指数Fig.1 Resistance index of Scirpus juncoides Roxb to bensulfuron-methylby two bioassay methods

2.2 萤蔺对吡嘧磺隆敏感性测定结果

2.2.1 琼脂法测定结果

由表5可知，平山种群对吡嘧磺隆表现最为敏感，IC50为20.1925 mg·L-1，将其设为敏感种群，以此得出其他种群抗性指数；牡04、五07和五04种群抗性指数为22.96、20.66和17.02，产生中等水平抗性；五站、五06、五08、五12、五11、牡02、五03、五10、通河、五02种群抗性指数分别为5.03、5.48、5.58、5.78、6.54、6.69、8.14、8.79、9.30、9.69，产生低水平抗性；五05种群抗性指数为3.15，处于敏感性下降阶段；平山等5个种群抗性指数＜3，处于敏感阶段。

2.2.2 整株法测定结果

由表6可知，涝洲种群对吡嘧磺隆表现最为敏感，ED50为90.1881 g·hm-2，将其设为敏感种群，以此得出其他种群抗性指数，牡04种群抗性指数为10.23，产生中等抗性；五07、五04、五11、五02、通河、五08种群抗性指数分别为8.24、8.15、6.67、6.06、5.91、5.84，产生低水平抗性；五05等6个种群抗性指数介于3～5，处于敏感性下降阶段，其余五06等6个种群处于敏感阶段。

2.2.3 两种方法测定萤蔺对吡嘧磺隆敏感性比较

由图2可知，在吡嘧磺隆处理下，利用琼脂法和整株法测定牡04种群抗性水平最高，分别为22.96和10.23，处于中等抗性水平，五12种群抗性指数分别为5.78和4.61，处于低水平抗性阶段，涝洲种群抗性指数分别为1.26和1.00，处于敏感阶段，琼脂法和整株法测定结果趋势一致，供试其他种群大多符合这一规律。

表5 萤蔺对吡嘧磺隆敏感性测定结果(琼脂法)Table 5 Susceptibility testofdifferentbiotypes of Scirpus juncoides Roxb to pyrazosulfuron-ethyl(Agar method)

表6 萤蔺对吡嘧磺隆敏感性测定结果(整株法)Table 6 Susceptibility testofdifferentbiotypes of Scirpus juncoides Roxb to pyrazosulfuron-ethyl(Whole plantmethod)

图2 两种方法测定萤蔺对吡嘧磺隆抗性指数Fig.2 Resistance index of Scirpus juncoides Roxb to pyrazosulfuron-ethylby two bioassay methods

3 讨论与结论

本研究采用琼脂法和整株法测定黑龙江省6个地区19个萤蔺种群抗药性水平，发现部分种群对苄嘧磺隆和吡嘧磺隆产生一定水平抗性。其中，对苄嘧磺隆：五07和通河种群产生中等水平抗性；牡04、五08、五04种群产生低水平抗性。对吡嘧磺隆：牡04种群产生中等水平抗性；五07等6个种群产生低水平抗性。

综合琼脂法和整株法抗性检测结果，发现两种方法检测结果趋势基本一致，但是不同种群整株法测定的抗性指数普遍小于琼脂法（见图1、2）。可能是采用琼脂法测定时，所设药剂浓度与田间真实使用剂量无可比性，导致除草剂对杂草产生夸大药效[8,10]。整株法中除草剂活性及使用情况类似田间，故被认为最适宜抗性鉴定方法[10-11]。但整株法工作量大、试验周期较长，因此在检测萤蔺生物型对苄嘧磺隆和吡嘧磺隆是否产生抗药性时，为确保省时省力、结果准确，可先利用更为灵敏、简便的琼脂法初步测定，然后再用更接近实际的整株法进一步验证可疑萤蔺种群，得出最后结论。

目前磺酰脲类在除草剂市场销量仅次于氨基酸类（草甘膦、草铵膦），位列第二，ALS是磺酰脲类除草剂唯一作用靶标[5]。由于作用位点单一，使用短短3～5年后即出现抗性杂草[12-13]，并且抗性杂草数量持续急剧攀升，成为抗性最严重的一类除草剂[14]。1982年澳大利亚发现抗磺酰脲类除草剂的瑞士黑麦草[15]。我国20世纪80年代后期稻田开始大面积推广苄嘧磺隆，不久使用吡嘧磺隆，两个磺酰脲类除草剂在黑龙江省使用已超过20年以上。随使用年限增加，我国已出现多种杂草对其产生抗药性的报道，吴明根等采用室内盆栽法研究发现延边地区雨久花对磺酰脲类除草剂产生抗药性，对苄嘧磺隆抗性指数（GR50）为10.3，对吡嘧磺隆抗性指数（GR50）为6.5[16]；卢宗志通过盆栽法测定吉林省柳河市和龙井县雨久花对苄嘧磺隆已产生较高抗性，抗性指数分别为13.7和12.2，对吡嘧磺隆抗性指数分别为8.4、8.3[17]；王兴国等通过琼脂法研究发现浙江地区宁波NB0143-01和绍兴SX077生物型对苄嘧磺隆RI分别高达124.4和120.4，宁绍平原和杭嘉湖平原稻区耳叶水苋对苄嘧磺隆已普遍出现抗性[18]。本研究利用琼脂法和整株法，发现黑龙江已有部分萤蔺种群对苄嘧磺隆和吡嘧磺隆产生一定水平抗性，说明黑龙江萤蔺亦对磺酰脲类除草剂产生抗药性。

在磺酰脲类除草剂抗性研究中，已证明杂草抗性主要是乙酰乳酸合成酶（Acetolactate synthase，ALS）变构和植物解毒代谢功能提高所致，且ALS遗传因子变异往往不只1个位点，结合部位变构直接影响ALS与化合物结合能力[19-21]。Uchino等表明萤蔺有2个ALS基因，ALS1和ALS2，任意一个基因单核苷酸取代均会导致氨基酸取代，从而对磺酰脲类除草剂产生抗药性。在抗磺酰脲类除草剂萤蔺氨基酸取代中，已发现第197位脯氨酸的12种取代（6种在ALS1上，6种在ALS2上），ALS2上第376位天冬氨酸被谷氨酸取代、第574位色氨酸被亮氨酸取代[22]。国内萤蔺对磺酰脲类除草剂抗性机制尚无报道，有待深入研究。

研究发现部分萤蔺生物型对苄嘧磺隆、吡嘧磺隆产生一定水平抗性，种群分别采自牡丹江地区、五常地区、通河地区，产生抗性原因与该地区用药历史至少在15年以上有密切关系；另一方面与当地使用磺酰脲类除草剂时任意加大使用剂量，长期使用单一除草剂品种有很大关系。对于已产生抗性种群，一方面需要对当地杂草抗性监测，加强监测力度，及时了解抗性萤蔺种群发展动态，以便采取相应措施，另一方面，建议当地使用其他种类除草剂或者人工防除等措施；对于处在敏感性下降阶段和敏感阶段种群，在除草剂使用过程中应注意与其他除草剂合理轮换，避免某一类除草剂高频率长时间使用，防止抗药性萤蔺大面积发生，对水稻生产造成重大损失。

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Resistance identification of Scirpus juncoides Roxb to bensulfuron- methyl and pyrazosulfuron-ethyl in Heilongjiang Province/

LIU Yaguang1,LI Min1,LI Wei1,ZHU Jinwen2,LIU Lankun1,SHI Hui1
(1.School of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.SchoolofAgriculture and Biotechnology,Zhejiang University,Key Laboratory of Molecular Biology of Crop Pathogens and Insects,Ministry of Agriculture,Hangzhou 310029,China)

Using 19 Scirpus juncoides Roxb populations collected from six areas of Heilongjiang Province as the objects ofstudy and using agar method and whole plant method to determine the different Scirpus juncoides Roxb population's resistant level to bensulfuron-methyl and pyrazosulfuron-ethyl.The results showed that the resistance indices in the same area were different by two means,but they had the same trend.Scirpus juncoides Roxb developed resistance to bensulfuron-methyl.The resistance index(RI) of population Wu07 and Tonghe were 11.72 and 10.36,respectively,and produced an intermediate levelof resistance.The RIofMu04,Wu08,Wu04 were 9.82,6.18 and 5.40,respectively,and produced a low levelof resistance.Scirpus juncoides Roxb developed resistance to pyrazosulfuron-ethylof which Mu04 developed an intermediate level of resistance with the RI of 10.23.Wu07 and other five populations developed a low resistance,whose RIranged from 5.84 to 8.24.

Scirpus juncoides Roxb;bensulfuron-methyl;pyrazosulfuron-ethyl;resistance

利用琼脂法、整株法测定黑龙江省6个地区19个萤蔺种群对苄嘧磺隆和吡嘧磺隆抗性水平。结果表明，两种方法测得同一地区抗性指数不同，但趋势相同。供试地区萤蔺对苄嘧磺隆产生抗性，其中五07和通河种群产生中等水平抗性，抗性指数分别为11.72和10.36；牡04、五08和五04产生低水平抗性，抗性指数分别为9.82、6.18和5.40。供试地区萤蔺对吡嘧磺隆产生抗性，其中牡04种群产生中等水平抗性，抗性指数10.23；五07等6个种群产生低水平抗性，抗性指数5.84～8.24。

萤蔺；苄嘧磺隆；吡嘧磺隆；抗药性

S481.4

A

1005-9369（2015）10-0029-08

时间2015-10-28 16:19:11[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20151028.1619.042.html

刘亚光,李敏,李威,等.黑龙江省萤蔺对苄嘧磺隆和吡嘧磺隆抗性测定[J].东北农业大学学报,2015,46(10):29-36.

Liu Yaguang,Limin,LiWei,etal.Resistance identification of Scirpus juncoides Roxb to bensulfuron-methyland pyrazosulfuron-ethylin Heilongjiang Province[J].Journalof NortheastAgricultural University,2015,46(10):29-36.(in Chinese with English abstract)

2015-04-19

国家自然科学基金项目（31171863）

刘亚光（1968-），女，教授，博士，研究方向为除草剂应用技术与杂草抗性。E-mail:liuyaguang929@163.com