在位子宫内膜神经生长因子在子宫内膜异位症中的表达及其临床意义

潘海英，王红静，徐 盼，杨凌云，贾西彪，陈 静，陈 岑

(四川大学华西第二医院，四川 成都 610041)

在位子宫内膜神经生长因子在子宫内膜异位症中的表达及其临床意义

潘海英，王红静，徐 盼，杨凌云，贾西彪，陈 静，陈 岑

(四川大学华西第二医院，四川 成都 610041)

目的 探讨在位子宫内膜神经生长因子(nerve growth factor，NGF)在子宫内膜异位症(endometriosis，EMS)中的表达及其临床意义。方法 选择2013年9 月至2014年3月在四川大学华西第二医院行手术治疗的EMS患者39例(A组)，其中疼痛22例(A1组)，无疼痛17例(A2组)。选择同期因宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)III行子宫切除的24例患者作为对照(B组)。采用免疫组化法检测各组子宫在位内膜中NGF的表达。结果 NGF在A组及B组在位子宫内膜上均有阳性表达，但A组、A1组NGF的表达均明显高于B组(P< 0.05)，A1组表达明显高于A2组(P< 0.05)，而A2与B组比较表达差异无统计学意义(P> 0.05)。结论 EMS患者在位子宫内膜 NGF表达增加，伴有疼痛者更明显。NGF可能参与了EMS疼痛的发生。

子宫内膜异位症；神经生长因子；疼痛

子宫内膜异位症(endometriosis，EMS)简称内异症，是子宫外含有子宫内膜腺体和基质的雌激素依赖性病变，始于细胞水平而止于盆腔疼痛和不孕[1]。80%的EMS患者有慢性盆腔痛(chronic pelvic pain，CPP)，主要表现为经期或经前后出现的腹痛、腰骶部疼痛，甚至剧痛难忍，严重影响患者生活质量和身心健康。EMS的发病机制至今尚不明确。近年来，越来越多的研究显示EMS疼痛与在位内膜神经纤维密度有关。神经营养因子(neurotrophin，NT)在诱导及维持神经纤维生长中起着重要的作用，而其中的在位子宫内膜神经生长因子(nerve growth factor，NGF)是产生疼痛及痛觉过敏的关键因素[2]，由此推测NGF可能与EMS患者的疼痛有关。本研究拟通过免疫组化法检测NGF在EMS在位内膜的表达，了解其在EMS疼痛发生中的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2013年9月至2014年3月在四川大学华西第二医院经手术病理证实为EMS且同意术中同时行诊刮术的39例患者(A组)，其中疼痛22例(A1组)和无疼痛17例(A2组)，A1组年龄22～49岁[(34.3±4.1)岁]，A2组年龄24～47岁[(35.7±6.3岁))。选择同期因CINIII行子宫切除的24例患者作为对照(B组)，年龄20～45岁[(31.3±5.1岁)]。A组排除子宫腺肌症和术前3月内接受过激素治疗的患者，B组排除EMS、子宫腺肌症和术前3月内接受过激素治疗的患者。A1、A2和B组在孕产次、年龄、月经周期等方面比较成差异均无统计学意义(P> 0.05)，A1组和A2组在手术分期分布上差异无统计学意义(P> 0.05)。

1.2 方法 分别提取病例组在位内膜组织和对照组在位内膜组织的石蜡切片，制成4 μm厚切片。采用免疫组化辣根过氧化物酶(HRP)-二甲基联苯胺(DAB)检测显示系统分析A，B两组中NGF的表达情况。试剂一抗多克隆兔抗人NGF抗体(工作浓度1∶100)购自北京希美杰生物技术有限公司。免疫组化SP试剂盒、DAB显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。用小鼠脑组织作为阳性对照，PBS液代替一抗作为阴性对照。用倒置生物显微镜观察切片，并对图像进行采集。

1.3 结果判定 参照Shimizu等[3]的免疫组化评分方法，进行半定量评分。显微镜下随机计数5个高倍视野(×200)，综合细胞染色强度及阳性细胞占总细胞数的百分比，进行半定量分析。染色强度评分标准：不着色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分，5%～为1分，25%～为2分，50%～为3分，≥75%为4分。每张切片读取5个视野的平均值，将细胞染色强度计分和阳性细胞比例计分相加，作为最后积分。根据最后积分，≤1分为阴性(-)，>1分且≤3分为弱阳性(+)，>3分且≤5分为阳性(++)，>5分为强阳性(+++)。EMS手术分期参照美国生育协会提出的“修正子宫内膜异位症分期法(1997年)”。

1.4 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件进行分析。计量资料以均数±标准差表示，采用t检验；计数资料采用χ2检验。P< 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

NGF在A组及B组在位子宫内膜上均有不同程度表达。阳性颗粒主要定位于子宫内膜腺上皮细胞的胞浆和胞膜。A组、A1组、A2组和B组NGF表达阳性率分别为76.9%、95.5%、52.9%和45.8%，其中A组、A1组均明显高于B组(P< 0.05)，A1组明显高于A2组(P< 0.05)。A2与B组比较差异无统计学意义(P> 0.05)，见表1及图1。

表1 不同分组NGF的表达

#A组与B组比较；## A1组与B组比较；### A1组与A2组比较；#### A2组与B组比较

3 讨论

EMS病因复杂，发病机制尚不清楚，目前推测神经机制可能在其发病中起着重要作用[4]。有研究显示内异症是一种混合炎症、神经性疼痛的病症[5]。Stratton 等[6]通过电子数据库检索1967年后报道的疼痛妇女的临床基础研究发现：内膜异位病灶可以诱发自己的神经支配，从而产生病变与中枢神经系统之间的直接和双向互动联系。

图1 NGF在子宫内膜的表达情况(DAB×200) a：NGF阴性表达；b：NGF弱阳性表达；c：NGF阳性表达；d：NGF强阳性表达

NT是一类由神经所支配的组织(如肌肉)和星形胶质细胞产生的且为神经元生长与存活所必需的蛋白质分子，对神经元的发育、存活和凋亡起重要作用。其中NGF是最早发现的神经因子，在神经纤维的生长、维持中起着重要作用。正常人的子宫肌层、子宫内膜与子宫肌层交界面及子宫内膜基底层的深部都有神经纤维支配，但子宫内膜的上2/3无神经纤维[7]。

EMS患者病灶内的高神经纤维分布与其神经因子高表达相伴出现。McKinnon 等[8]检测了EMS患者异位组织神经纤维及腹腔液神经因子浓度，结果显示与EMS相关的疼痛和腹腔液神经因子的浓度有关。Barcena[9]进行神经营养因子的前瞻性临床研究，比较了EMS、子宫腺肌病、盆腔粘连患者腹腔液中神经生长因子(NGF)、脑源性神经因子(Brain derived neurotrophic factor，BDNF)和神经营养因子3(Neurotrophin-3，NT-3)的浓度，发现内异症患者腹腔液中NGF、BDNF的浓度明显升高。Kajitani等[10]通过测定EMS患者与非EMS患者腹腔液中NGF的表达，发现EMS患者腹腔液中的NGF表达水平显著高于常人水平。

我们研究了NGF因子在EMS与非EMS患者在位子宫内膜上的表达，结果显示：NGF在EMS患者在位内膜的表达明显高于对照组，差异有统计学意义。其中又尤以在EMS疼痛患者在位内膜中的表达最高，高达95.5%，其明显高于非疼痛组及对照组，差异均有统计学意义。非疼痛组与对照组相比，NGF表达略高，但差异无统计学意义，提示NGF主要通过参与EMS的疼痛而参与EMS的发生。

NGF参与EMS疼痛发生的神经机制可能与下列因素有关：NGF及其受体增加能促进感觉神经纤维的增生。Arnold[11]报道内异症腹膜病灶中交感神经纤维密度降低而感觉神经纤维密度增加。Bokor等[12]研究显示：小神经纤维的密度在轻度子宫内膜异位患者的子宫内膜中与正常盆腔的患者相比高出14倍。NGF本身亦是一种疼痛介质，能诱导与调控与中枢疼痛传导有关的P物质(Substance P，SP)、降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)及神经丝(neurofilament，NF)的表达。肾上腺能神经末梢释放前列腺素E2，前列环素(prostacyclin，PGI2)，这些物质能使感觉神经C致敏[13]。作为重要的前列腺素合成限速酶的环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，Cox-2)能增加侵袭性、诱导血管形成，在内膜异位症患者的在位内膜，其表达亦明显增高，使之有助于内膜细胞的粘附侵袭。这也符合我国学者提出的“在位内膜决定论”。而EMS患者病灶中的神经纤维可能即来源于在位内膜功能层的神经纤维，或是有活性的在位内膜脱落后，种植在腹腔等其他部位时所分泌的能促进神经生长的细胞因子如NGF。EMS腺体和血管附近有神经生长因子受体p75(NGFRp75)阳性的神经纤维表达，神经生长因子通过EMS腺体产生免疫反应[14]。这提示腹膜子宫内膜异位病灶可能受感觉神经A、感觉神经C、胆碱能和肾上腺素能神经纤维支配。Barcena de Arellano等[15]比较EMS患者与其他妇科患者的腹腔液神经元生长的体外模型和NGF的表达，发现EMS和子宫内膜异位病灶的腹腔液具有亲神经性。EMS是激素依耐性疾病，雌二醇和孕激素均能刺激NGF在间质细胞的表达，而使用孕激素后，NGF受体则明显减弱[16]。

本研究发现在EMS在位内膜中有NGF表达，且疼痛患者中表达更显著，提示NGF可能参与了EMS疼痛的发生。由此说明采用在位内膜免疫组化标记NGF作为具有疼痛的EMS患者的筛查以及采用神经因子拮抗阻断治疗EMS疼痛患者将是可行的。

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The expression of nerve growth factor and its significance in eutopic endometrium of patients with endometriosis

PAN Hai-ying，WANG Hong-jing，XU Pan，YANG Ling-yun，JIA Xi-biao，CHEN Jing，CHEN Cen

(West China Second Hospital，Sichuan University，Chengdu 610041，China)

WANGHong-jing

Objective To investigate the expression of nerve growth factor(NGF)in eutopic endometrium of patients with endometriosis，and to explore the role of NGF in the development of endometriosis-associated pain.Methods A total of 63 patients underwent surgical were studied.Of these patients，39 underwent surgical endometriosis lesion excision(group A)in which 22 patients suffered from dysmenorrheal(group A1)and 17 patients had no dysmenorrheal(group A2).At the same time，24 patients undergone uterectomy because of cervical intraepithelial neoplasia(CIN)were used as control group(group B).Immunohistochemistry was performed to detect the expression of NGF in eutopic endometrium.Results The level of NGF of endometrium in the group A and the group A1 were significantly higher than that in the group B(P< 0.05).The level of NGF in endometrium in the group A1 was significantly higher than that in the group A2(P< 0.05).There was no statistically significant difference in NGF expression between the group A2 and group B(P> 0.05).Conclusion NGF express in endometrium of patients with dysmenorrhea may participate in the pathogenesis of endometriosis and endometriosis associated pain.

Endometriosis；Nerve growth factor；Dysmenorrhea

四川省科技厅科技支撑基金资助项目(编号：2012 SZ0022)

王红静

R711.71

A

1672-6170(2015)05-0111-03

2015-01-30；

2015-05-27)