牛副流感病毒3型N基因的克隆与系统进化分析

薛 娟，曹 思，张 峣，冉旭华，闻晓波

（黑龙江八一农垦大学动物科技学院预防兽医学省重点实验室，黑龙江大庆 163319）

牛副流感病毒3型（Bovine parainfluenza virus type 3，BPIV-3）属于副黏病毒科副黏病毒属成员，为单股负链有囊膜的RNA病毒［1］，我国于2010年成功分离得到该病毒。BPIV-3在临床上是牛呼吸道疾病综合征（Bovine respiratory disease complex，BRDC）的主要病原［2］，而牛呼吸道疾病综合征是引起世界范围内的舍饲牛发病和死亡的主要原因［3］，多国均有该病发生的报道［4］。牛副流感病毒3型属于呼吸道病毒［5］，同属的成员还有人副流感病毒3型、人副流感病毒1型和仙台病毒。BPIV-3是一类重要的人畜共患病毒，与人副流感病毒3型的结构蛋白HN、F、N、P、C和M蛋白的氨基酸序列高度相似［6］。其中N蛋白相似度高达86%，这预示着该基因保守性可能较高。

本试验针对BPIV-3-N基因进行研究。根据GenBank上已知参考序列设计一对特异性引物，采用RT-PCR方法扩增从大庆地区某牛场患有呼吸道疾病的病牛体内分离得到的BPIV-3N基因，并用分子生物学软件对其核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析，为研究该病毒的地理分布及分子流行病学特点提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 BPIV-3从黑龙江大庆地区某牛场患有呼吸道疾病的病牛鼻液中分离得到，由黑龙江八一农垦大学动物科技学院预防兽医学省重点实验室保存备用。

1.1.2 酶和试剂 pfu DNA Polymerase，MMuLV Reverse Transcriptase，Fermentas公司产品；Wizard®SV Gel and PCR Clean-Up System A9280试剂盒、DNA Marker DL 2 000、6×Loading buffer、dNTP（2.5mmol／L）、BamH Ⅰ、Hind Ⅲ、pMD®18-T Vector，TaKaRa公司产品；Trizol，Invitrogen公司产品；质粒小提试剂盒，Tiangen公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 参考GenBank上收录的BPIV-3基因全序列（GenBank：AB770484.1），设计特异性引物，委托北京六合华大基因科技股份有限公司合成。BPIV-3-N-Up：GCCGAAAGGTGAGGGGAAAGAAATC；BPIV-3-N-Low：ACTTGTTGCTGATGATGGTGATC。

1.2.2 RNA的提取及RT-PCR扩增 取病毒液，参照TRIzol使用说明书进行RNA提取，取样品RNA进行反转录，反转录体系如下：RNA 3μL，引物1μL，混匀，70℃5min，冰浴2min；加入5×Reaction buffer 4μL，RiboLockTMRibounuclease inhibitor 0.5μL，dNTP（2.5mmol／L）8μL，混匀，37℃5min，冰浴2min；加入 M-MuLV Reverse trabscriptase 2μL，混匀，37℃2h，70℃10min终止反应。获得cDNA后立即进行PCR，反应体系如下：10 × pfu buffer with MgSO42 μL，dNTP 2.5mmol／L 1.6μL，BPIV-3-N-Up和 BPIV-3-NLow各0.2μL，cDNA 1μL，pfu DNA polymerase 0.4μL，加入灭菌纯水将体积补至20μL。扩增程序如下：95℃3min；95℃30s，52℃30s，72℃2min 48s，35个循环；72℃10min。

1.2.3 PCR产物的克隆与测序 采用 Wizard®SV Gel and PCR Clean-Up System 试剂盒对PCR产物进行纯化。纯化后产物与pMD18-T载体连接，转化至大肠埃希菌DH5α感受态细胞中，均匀涂布在含氨苄青霉素（终浓度为100μg／mL）的LB固体培养基上，挑取单个菌落培养，碱裂解法小量提取质粒。重组质粒经BamHⅠ、HindⅢ双酶切鉴定后，阳性质粒命名为pMD18-T-BPIV-3-N，并送往北京六合华大基因测序。

1.2.4 序列分析 通过 NCBI Blast分析，选取同源性较高的序列作为参考序列，进行分析，参考毒株见表1。应用DNA Star Megalign，DNA Man等软件进行核苷酸序列与氨基酸同源性比较分析。

表1 BPIV-3-N序列分析参考毒株Table 1 Reference strains of BPIV-3-N sequence analysis

2 结果

2.1 RT-PCR结果

以牛副流感病毒3型的cDNA为模板，BPIV-3-N-UP、BPIV-3-N-LOW 为引物扩增出一条1 548bp的片段，与预期大小相符（图1）。

图1 BPIV-3-N的RT-PCR产物电泳图Fig.1 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR products of BPIV-3-N

2.2 重组质粒的鉴定

将PCR产物克隆到pMD18-T载体上，并转入到大肠埃希菌DH5α感受态细胞中，挑取单个菌落，碱裂解法小量提取质粒，重组质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切鉴定后（图2），阳性质粒命名为pMD18-T-BPIV-3-N。将阳性样品送往北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

图2 重组质粒pMD18-T-BPIV3-N双酶切产物电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis of the double enzyme digestion products of recombinant plasmids pMD18-T-BPIV3-N

2.3 测序结果及序列比较分析

测序结果表明扩增获得的BPIV-3-N基因全长1 548bp，编码515个氨基酸，推测其分子质量为52.7ku。利用DNA Star软件对BPIV-3-N核苷酸序列及氨基酸序列进行同源性分析，结果见图3，表明该序列与日本分离的910N株的N基因同源性较高（氨基酸同源性为100%，核苷酸同源性为99.7%），此外，该序列与来自日本的疫苗株BN-CE与BN-1也有同样高的同源性（氨基酸同源性为100%，核苷酸同源性为99.7%）。另外，该序列与中国的分离株SD0835同源性较低（氨基酸同源性仅有60.9%，核苷酸同源性也只达到82.5%）。

图3 同源性分析Fig.3 Analysis of homology

3 讨论

据美国学者Snowder G D等［7］研究发现BPIV-3是引起BRDC的主要病原之一，BRDC已经成为威胁大规模饲舍养牛的重要疾病之一［8］。但截止目前，人们对于BPIV-3的研究还处于初级阶段，目前我国尚无商品化疫苗可供使用，对于其致病机理尚未明确，而流行病学特点的研究也并不完善。

BPIV-3基因组全长15 456bp，编码了包括核衣壳蛋白（N）在内的8种结构蛋白。BPIV至少含有6种蛋白，即N、P、F、M、HN、L等蛋白，具有血凝素与神经氨酸酶活性。N基因编码核衣壳蛋白，约编码515个氨基酸。N蛋白是核衣壳的主要成分，与病毒的RNA直接结合，高度保守，在病毒感染时可以引起强烈的抗原反应［9］。

核衣壳蛋白是BPIV-3的重要结构蛋白，在8种结构蛋白中该蛋白的保守性最高，所以通常也将其的作为BPIV-3的鉴定基因。N蛋白单体呈螺旋状结构，大量的N蛋白单体相互结合构成了一个中空的管道状结构，即病毒的核衣壳。该结构可以保护病毒的RNA不被核酶降解。核衣壳的C端结构域上含有种属抗原决定簇和对蛋白酶敏感的磷酸化位点，因此N蛋白具有很好的免疫原性，能够诱发机体产生免疫应答［10］。本试验所获得的N基因序列分析表明，该分离株C端结构完整与参考序列无明显差异，氨基酸分析表明该毒株与日本分离株同源性较高，与中国分离株同源性较低。本研究为进一步研究BPIV-3流行病学特点提供了参考。

［1］Schmidt A C，McAuliffe J M，Huang A，et al.Bovine parainfluenza virus type 3（BPIV3）fusion and hemagglutinin-neuraminidase glycoproteins make an important contribution to the re-stricted replication of BPIV3in primates［J］.J Virol，2000，74（19）：8922-8929.

［2］Ohkura T，Kokuho T，Konishi M，et al.Complete genome sequences of bovine parainfluenza virus type 3strain BN-1and vaccine strain BN-CE［J］.Genome Announc，2013，doi：10.1128／genomeA.00247-12..

［3］Lin X Q，O＇Reilly K L，Storz J.Antibody responses of cattle with respiratory coronavirus infections during pathogenesis of shipping fever pneumonia are lower with antigens of enteric strains than with those of a respiratory strain［J］.Clin Diagn Lab Immunol，2002，9（5）：1010-1013.

［4］Griffin D.Economic impact associated with respiratory disease in beef cattle［J］.Vet Clin North Am Food Anim Pract，1997，13（3）：367-377.

［5］Maidana S S，Lomonaco P M，Combessies G，et al.Isolation and characterization of bovine parainfluenza virus type 3from water buffaloes（Bubalusbubalis）in Argentina［J］.BMC Vet Res，2012（8）：doi：10.1186／1746-6148-8-83.

［6］Tsai K S，Thomson R G.Bovine parainfluenza type 3virus infection：virus replication in bovine embryonic cell cultures and virion separation by rate-zonal centrifugation［J］.Infect Immun，1975，11（4）：770-782.

［7］Snowder G D，Van Vleck L D，Cundiff L V，et al.Bovine respiratory disease in feedlot cattle：environmental，genetic，and economic factors［J］.J Anim Sci，2006，84（8）：1999-2008.

［8］Haanes E J，Guimond P，Wardley R.The bovine parainfluenza virus type-3（BPIV-3）hemagglutinin／neuraminidase glycoprotein expressed in baculovirus protects calves against experimental BPIV-3challenge［J］.Vaccine，1997，15（6-7）：730-738.

［9］Bryson D G，McNulty M S，McCracken R M，et al.Ultrastructural features of experimental parainfluenza type 3virus pneumonia in calves［J］.J Comp Pathol，1983，93（3）：397-414.

［10］曹 丽，高维凡，温永俊.牛副流感病毒3型NP基因原核表达及纯化［J］.动物医学进展，2014，35（2）：20-28.