布鲁菌外膜蛋白Omp22基因的原核表达与生物信息学分析

朱华培，赵天靖，徐开莲，贾晓晓，郭莳雨，史巧芸，庞 峰，荣 辉，张珈宁，成 鹰，焦寒伟，杜 丽，王凤阳

（海南大学农学院，海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室，海口市动物基因工程重点实验室，海南海口 570228）

布鲁菌病（Brucellosis）是由布鲁菌引起的人兽共患性传染病，其临床特点为长期发热、多汗、关节痛及肝脾肿大等［1］。布鲁菌（Brucella）为革兰阴性小杆菌。大多数动物都可感染布鲁菌，但以羊、牛、猪最为易感，人也可感染布鲁菌［2］。近年来人感染布鲁菌在我国部分地区呈上升之势，据中国疾病控制与防控中心报道，2010年新增人感染布鲁菌病例35 000多例［3-4］。

布鲁菌免疫原性和抗原保护作用可能与布鲁菌的外膜蛋白有关。当前可用的商业性活布鲁菌疫苗有严重的内在缺陷，这就是为什么在许多国家倾向于布鲁菌疫苗接种限制［5］。近期，有研究表明外膜蛋白22（Omp22）可能暴露于S菌的表面，与细菌的脂多糖一样都能够诱导产生保护性免疫反应［6］，Omp22具有高保守性，是一种免疫优势抗原与布鲁菌毒力相关［7］。

本试验通过对布鲁菌外膜蛋白基因Omp22进行表达和生物信息学分析，以期为布鲁菌病的预防、基因工程疫苗及免疫诊断和治疗等方面的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

布鲁菌M5-90株基因组和E.coliDH5α和E.coliBL21（DE3），由海口市动物基因工程重点实验室保存；原核表达载体pET-28a（＋），上海捷瑞生物工程有限公司产品；凝胶回收试剂盒、pMD20-T Vector试剂盒，宝生物工程（大连）有限公司产品；兔抗His单克隆抗体，Merck公司产品；HRP标记山羊抗兔IgG，Invitrogen公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物的设计与合成 根据Omp22外膜蛋白基因的编码框（基因序列号：JX040477.1），利用DNA Man自行设计上下游引物，设计完成后送上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如 下：Omp22-forword：5′-CGGGATCCATGTTCAAGCGTTCTATCAC-3′；Omp22-reverse：5′-CCGCTCGAGGCTAGAATTTGTAGTTCAGG-3′，下划线划出分别是BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点。

1.2.2 目的片段的获得及克隆 配制25μL的PCR反应体系，按以下程序进行PCR反应：94℃3min；94℃30s，67℃ 40s，72 ℃ 1min，25个循环；72℃10min，16℃结束反应。待PCR反应结束后进行琼脂糖凝胶检测并回收纯化目的基因片段。将纯化的PCR产物与pMD-20T载体16℃过夜连接，构建重组质粒pMD-20T-Omp22，转化E.coliDH5α感受态细胞。进行阳性筛选后，挑取单菌落过夜摇菌，增菌培养后提取质粒，对质粒进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定后，送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。

1.2.3 原核表达载体pET-28a-Omp22的构建 将PCR产物和pET-28a质粒分别进行BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后回收，将这两种回收产物在T4连接酶的作用下，16 ℃连接过夜，转化E.coliBL21（DE3），挑取阳性菌落摇菌过夜提取质粒，BamHⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定重组质粒，送北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。

1.2.4 Omp22基因的原核表达 参考文献［8］进行原核表达。将含阳性重组质粒的细菌培养物于37℃、200r／min培养，选取 D600nm＝0.5时，IPTG至终浓度为0.01mmol／L，诱导5h取样，进行SDS-PAGE检测。

1.2.5 融合蛋白的 Western blot鉴定 参照文献［9］方法将目的蛋白转到PVDF膜上，用含50g／L脱脂牛奶的TBS室温静置封闭2h，加入1∶2 000稀释的兔抗布鲁菌抗体血清，室温孵化培育2h后，用TBST（含0.5mL／L Tween-20）洗膜5次，每次5min。再加入1∶5 000稀释的His-羊抗兔二抗，室温孵育1.5h，用TBST洗涤5次后DAB显色，再用去离子水终止显色。

2 结果

2.1 Omp22基因的鉴定

用10g／L的琼脂糖对PCR扩增产物进行凝胶电泳，可见到在约656bp处有明显的目的基因条带，与Omp22目的基因的理论值大小相符合（图1）。pMD-20T-Omp22测序结果与GenBank中录入的羊种布鲁菌M5-90株Omp22基因序列相符。

图1 PCR扩增Omp22基因Fig.1 PCR amplification of Omp22gene

2.2 重组质粒pET-28a-Omp22鉴定

重组质粒pET-28a-Omp22用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切鉴定。琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，能见到大约在5 400bp和656bp处有亮条带，结果与载体pET-28a（＋）和Omp22基因的理论大小符合（图2）。

图2 质粒pET-28a-Omp22双酶切鉴定Fig.2 The identification of recombinant plasmid pET-28a-Omp22 by double enzyme digestion

2.3 Omp22基因的原核表达

选取IPTG不同的浓度进行诱导表达，经过试验可知在IPTG浓度为0.01mmol／L和5h时的诱导效果最好，产生的蛋白量最高（图3）。

图3 Omp22基因的原核表达Fig.3 Prokaryotic expression of Omp22gene

2.4 Omp22诱导蛋白的 Westrn blot鉴定

对His-Omp22诱导蛋白进行 Western blot鉴定，有阳性条带，E.coliBL（DE3）阴性对照则无（图4），结果表明，大小与目的蛋白理论值符合，并且诱导蛋白能够被兔抗His单克隆抗体识别，证明为Omp22的His融合蛋白。

图4 Western blot鉴定Fig.4 Western blot identification

2.5 Omp22蛋白生物信息学分析

DNA Man软件对Omp22核苷酸序列和氨基酸序列进行分析及预测。http：／／npsa-pbil.ibcp.fr／cgi-bin／npsa automat.pl？page＝npsa sopma.html对Omp22蛋白进行二级结构分析，结果为其中α-螺旋占22.17%，伸展链占19.81%，β-折叠占2.83%，无规卷曲占55.19%（图5）。

Bioedit软件对Omp22基因编码氨基酸进行Kyte＆Doolittle平均疏水性轮廓分析，横轴代表目的基因氨基酸的位数，纵轴代表亲水分值的大小，曲线的分值越低，其亲水性越高。结果为Omp22蛋白在-1.8～＋1.2之间分布大部分疏水性区域，表明目的基因编码的蛋白质为跨膜蛋白且有较高的亲水性（图6）。

图5 Omp22蛋白二级结构分析Fig.5 Analysis of secondary structure of Omp22protein

图6 Omp22蛋白疏水分析Fig.6 Analysis of hydrophobicity of Omp22protein

3 讨论

目前，国内外针对布鲁菌病的诊断及检疫主要依据试管凝集试验等方法，这些方法不仅耗时耗力，且特异性和敏感性较差，有时还会出现漏检现象，无法区分是疫苗免疫还是自然感染，对该病的检疫和诊断带来诸多不便［10］。随着研究的深入，发现部分具有免疫原性的外膜蛋白（Omp）能够对布鲁菌病的诊断和新一代疫苗研制起到积极作用。

布鲁菌外膜蛋白Omp22属于Omp25／Omp31家族，相对于家族其他几种蛋白，针对Omp22蛋白的研究较少［11］。本研究选取的Omp22也是布鲁菌的外膜蛋白，通过研究证实Omp22与布鲁菌的侵袭和毒力有关，是一种毒力因子。能够分泌表达于细菌表面，并能够引起Th1细胞较高的免疫反应［12］。Omp22具有最高的黏附能力和侵袭大肠埃希菌的重组蛋白过度表达的能力，除了山羊Flgk基因外，所有的蛋白质与暴露的山羊、小鼠、人的混合血清有关［13］。这就为以Omp22蛋白作为诊断抗原检测布鲁菌并且生产相应的基因疫苗奠定了基础。同时Omp22的高保守性也为研制新一代的布鲁菌疫苗和抗体必不可少的。Omp22蛋白具有高亲水性，系膜孔蛋白也是外膜蛋白，这对布鲁菌在宿主体内的快速繁殖和大量存在有利。Omp22的研究对布鲁菌病的诊断和治疗很重要。

本试验通过构建原核表达载体pET-28a-Omp22并在大肠埃希菌中诱导表达，这就为Omp22基因蛋白的大量表达以及纯化奠定基础，也为布鲁菌Omp22蛋白的功能研究以及单克隆抗体和疫苗的研制奠定了基础。

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