禽流感病毒H5、H7和H9亚型一步法多重RT-PCR检测方法的建立

屈素洁，莫胜兰，邹联斌，胡 杰，张步娴，梁 媛，粟艳琼，施开创，李 军

（广西壮族自治区动物疫病预防控制中心，广西南宁 530001）

禽流感（Avian influenza，AI）是由正黏病毒科 （Orthomyxoviridae）A 型流感病毒属中不同亚型病毒引起的禽类感染和疾病的总称。禽流感病毒（AIV）为单股负链RNA病毒，基因组有8个独立的RNA节段组成，根据其表面血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）的抗原性差异，可分为16个HA亚型和9个NA亚型［1-2］，AIV抗原变异性强，宿主范围广泛，且亚型之间无交叉保护性，使得禽流感频繁暴发。高致病性禽流感主要是由H5或H7亚型AIV引起的，潜伏期极短，突然暴发，多不见任何临床症状而突然死亡，发病率和病死率高达100%［3］，另外还可感染人，甚至导致死亡［4-5］。目前，我国部分地区以H9亚型为主的中低致病性禽流感的流行，给养禽业造成很大的经济损失，已引起国内各界学者的广泛关注［6］。早期快速检测无疑是预防、控制禽流感的关键。

禽流感的诊断，包括病原的分离鉴定、琼脂扩散试验、血凝和血凝抑制试验、免疫荧光法和ELISA等常规方法发挥了重要作用，但这些方法操作比较繁琐，费时、费力。聚合酶链反应（PCR）方法不仅特异、敏感，而且简易、快速。多重PCR是一种特殊PCR形式，其最突出特点是可同时检测、鉴别出多种病原体［7-9］，极大地缩短禽流感病毒的检出时间，为AIV早期快速诊断提供了敏感、快速、实用的方法。本试验采用了多重RT-PCR技术，建立了能同时检测H5、H7和H9亚型AIV的一步法多重RT-PCR方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 毒株和质粒 禽流感病毒（AIV-H1毒株、AIV-H3毒株、AIV-H5毒株、AIV-H6毒株、AIVH9毒株）、鸡新城疫病毒（NDV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、传染性喉气管炎病毒（ILTV）、鸡毒支原体（MG）及鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）均由广西壮族自治区动物疫病预防控制中心保存；AIV-H7亚型质粒由哈尔滨兽医研究所提供。

1.1.2 试剂 RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、胶回收试剂盒、pMD18-T载体，宝生物工程（大连）有限公司产品；DH5α感受态细胞，Tiangen公司产品；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 参照GenBank中公布的 H5、H7和H9亚型AIV的HA基因序列，通过MegAligen软件进行比对，应用Primer 5.0软件设计3对引物（表1），引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

1.2.2 病毒RNA的提取 参照RNA提取试剂盒操作说明书进行。

表1 多重RT-PCR引物Table 1 Multiplex RT-PCR primers

1.2.3 一步法多重RT-PCR反应 参照一步法RT-PCR试剂盒操作说明，RT-PCR反应体系，即PrimeScript 1step Enzyme Mix 2μL，2×step buffer 25μL，上、下游引物各1μL（10μmol／L），RNA模板10μL，加ddH2O至50μL。反应条件，即50℃30min；95℃2min；94℃45s，55℃45s，72℃1min，共35个循环。反应结束后取产物5μL～10μL用12g／L琼脂糖凝胶进行电泳，观察扩增结果。

1.2.4 PCR产物测序 用胶回收试剂盒，从琼脂糖凝胶中回收PCR产物，将回收产物与pMD18-T载体连接，转化DH 5α感受态细胞后，送宝生物工程（大连）有限公司进行序列测定。

1.2.5 特异性试验 用上述方法对禽流感病毒（AIV-H1毒株、AIV-H3毒株、AIV-H6毒株）、鸡新城疫病毒（NDV）、鸡传染性支气管炎病毒（IBV）、传染性喉气管炎病毒（ILTV）、鸡毒支原体（MG）及鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）的病毒材料进行进行特异性检测试验。

1.2.6 敏感性测定 将 H5、H7和 H9亚型AIV的RNA做10倍系列稀释后进行多重RT-PCR，测定该一步法多重RT-PCR对RNA的最低检测量。

2 结果

2.1 RT-PCR扩增结果

禽流感病毒H5、H7和H9型扩增后获得的片段与预期大小完全一致，分别为380、501、732bp（图1）。

2.2 测序鉴定

分别将测得的H5亚型序列同GenBank登录号为HM172455、JX534549等5株，H7亚型序列同GenBank登录号为KJ415825、KF420296等5株，H9亚型序列同GenBank登录号为DQ064366、DQ064366等5株亚型序列同源性比较，结果都大于80% ，证明PCR所扩出的片段分别为H5、H7和H9亚型的特异性片段。

图1 一步法多重RT-PCR扩增结果Fig.1 The results of one step-multiplex RT-PCR

2.3 特异性试验

H5、H7、H9亚型 AIV RNA经一步法多重RT-PCR扩增，在380、501、732bp分别出现了扩增条带，而 H1、H3、H6亚型 AIV，NDV、MG、IBV和ILTV均无扩增条带出现，即为阴性（图2），表明H5、H7和H9亚型AIV与其他亚型AIV和禽呼吸道病原体的核酸不存在交叉反应，特异性强。

图2 一步法多重RT-PCR的特异性试验Fig.2 Specificity test of the one step-multiplex RT-PCR

2.4 敏感性试验

经测定，该一步法多重RT-PCR对H5、H7和H9亚型AIV RNA的最低检测量分别为10-4、10-4、10-2拷贝／μL（图3）。

3 讨论

图3 一步法多重RT-PCR敏感性试验Fig.3 Sensitivity test of the one step-multiplex RT-PCR

传统禽流感诊断方法主要有病毒分离培养和血清学试验，这些方法操作繁琐，时间长，重复性不好［10］。AIV血清型众多，且新的变异株不断出现，而制备血清型特异性单克隆抗体相对困难。近几年研究发现，接种鸡胚进行A型流感病毒增毒过程中，发生了介导变异［11］，所有这些限制了传统方法在实际中的应用。RT-PCR作为一种灵敏、快速简便而且经济实用的检测方法已经在许多领域得到广泛应用，尤其是多重RT-PCR倍受青睐，当样品数量大、病原亚型多时，多重RT-PCR显示出独特的优势，能够高通量、低成本进行批量快速检测多个亚型［12-13］。

本研究引物是根据禽流感病毒亚型决定片段HA片段进行的引物设计，建立了H5、H7和H9亚型禽流感病毒一步法多重RT-PCR检测方法。可对H5、H7和H9亚型进行一次性区分，避免了二次检验，省时、省力，而且节约了资源。建立多重RTPCR对引物的要求相当高。在同一体系中同时加入多对引物，同时扩增多个基因，引物对之间的匹配与否对多重RT-PCR的扩增结果影响很大，尤其是体系的特异性。因此，在设计PCR引物时要考虑多个因素，如引物的退火温度应大致相近，基因片段大小有一定梯度，以便于电泳分辨等。

以H5、H7和H9亚型流感病毒RNA作为模板进行一步法多重RT-PCR扩增，能够扩增出大小为380、501、732bp的3个条带，而以 AIV H1亚型、AIV H3亚型、AIV H6亚型、NDV、MG、IBV、IBDV和ILTV总RNA作为模板，却不能扩增出任何条带，表明该检测方法特异性强。将抽提并测定含量的病毒RNA进行10倍稀释，分别作为模板进行一步法多重RT-PCR扩增。结果表明，该多重RT-PCR对H5、H7和H9亚型AIV RNA的最低检出量分别为10-4、10-4、10-2拷贝／μL，表明该检测方法敏感度高。

本研究建立的一步法多重RT-PCR同时鉴别H5、H7和H9亚型AIV的方法，为禽流感的防控提供了有效的早期快速检测手段奠定了基础，因此在维护公共卫生安全方面具有十分重要的意义。

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