蒸发光散射高效液相色谱法测定黄芪饮片中的黄芪甲苷含量

荀其宁，侯倩倩，刘志娟，许峰，张文申，刘霞，冀克俭

(中国兵器工业集团第五三研究所，济南 250031 )

蒸发光散射高效液相色谱法测定黄芪饮片中的黄芪甲苷含量

荀其宁，侯倩倩，刘志娟，许峰，张文申，刘霞，冀克俭

(中国兵器工业集团第五三研究所，济南 250031 )

采用蒸发光散射高效液相色谱法测定黄芪饮片中黄芪甲苷的含量。黄芪饮片分别用甲醇和正丁醇提取，以NaOH溶液洗涤，蒸干，再用甲醇溶解，采用Agilent SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)分离测定，流动相为乙腈-水(32∶68)，流量为1.0 mL/min，漂移管温度为80℃。方法检出限为1.5 μg/mL，黄芪甲苷溶液的质量浓度在2～12 μg/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好(r2=0.999 6)，测定结果的相对标准偏差为0.65%（n=6），平均加标回收率为99.6%。该方法稳定可靠，可用于黄芪药材及其生物制品中黄芪甲苷含量的测定。

黄芪；黄芪甲苷；液相色谱；蒸发光散射检测器

黄芪为豆科植物蒙古黄芪或膜荚黄芪的干燥根，味甘，性微温，具有清热燥湿、补气固表、利尿脱毒排脓、敛疮生肌之功效［1］。黄芪含皂苷、黄酮、多糖及氨基酸等多种化学成分，其中黄芪甲苷为黄芪中的主要活性成分，是黄芪药材及其制剂质量控制的指标性成分［2-5］。黄芪收载于《中国药典》2010版（一部）。

黄芪甲苷常用的含量测定方法有薄层扫描法和高效液相色谱法。薄层扫描法操作繁琐，测定结果重现性差。常规的高效液相色谱-紫外检测器不适用于黄芪甲苷的检测，因为黄芪甲苷仅在200 nm左右有微弱的吸收，检测灵敏度低，噪音大［6-9］。而蒸发光散射检测器对黄芪甲苷具有较高的检测灵敏度，在实验中得到广泛应用［10-16］。笔者对样品前处理方法进行优化处理，建立了一种准确可靠的黄芪甲苷含量测定方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱仪：Agilent 1260型，配有蒸发光散射检测器，美国安捷伦科技有限公司；

分析天平：ABS135-S型，美国梅特勒-托利多公司；

超声波清洗器：KQ5200型，昆山市超声仪器有限公司；

甲醇、乙醇：色谱纯，美国Fisher Scientific公司；

正丁醇：分析纯，山东莱阳经济技术开发区精细化工厂；

氢氧化钠：分析纯，天津天大化工实验室；

高纯氮气：纯度为99.999%，济南尧天仪器有限公司；

黄芪甲苷对照品：编号为110781，纯度为95.8%，中国食品药品检定研究所；

黄芪饮片样品：市售；

实验用水为高纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：Agilent SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-水(体积比为32∶68)，流量为1.0 mL/min；柱温：35℃；进样体积：20 μL；喷雾器温度：60℃；漂移管温度：80℃。

1.3 溶液的配制

1.3.1 黄芪甲苷对照品溶液

精密称取黄芪甲苷对照品5 mg于10 mL容量瓶中，加入甲醇定容至标线，摇匀即得。

1.3.2 黄芪饮片样品溶液

取黄芪饮片适量，于50℃干燥至恒重，用研钵研磨成粉，过380 μm（40目）筛。取4 g粉末，置于索氏提取器中，加入40 mL甲醇，冷浸过夜。隔天加甲醇适量，加热回流4 h，将提取液回收并浓缩至干。残渣加水10 mL，微热使其溶解，分别用40 mL水饱和的正丁醇振摇提取4次后合并正丁醇液。分别用40 mL 1% NaOH溶液（替代药典方法中的氨试液）充分洗涤2次，弃去1% NaOH溶液，将正丁醇液蒸干。加水5 mL溶解残渣，放冷，注入D101型大孔吸附树脂柱（12 cm×1.5 cm），以50 mL水洗脱，弃去，然后用30 mL 40%乙醇洗脱，弃去，再用80 mL 70%乙醇洗脱，弃去。蒸干后残渣加甲醇溶解并转移至5 mL容量瓶中，用甲醇定容至标线，摇匀，用0.45μm滤膜滤过，即得。

2 结果与讨论

2.1 样品处理方法

黄芪饮片样品的前处理对含量测定影响较大，注意事项主要包括：（1）用索氏提取器提取时，供试品需全部浸泡在甲醇中，约20 min虹吸一次，加热回流6 h；（2）用水饱和正丁醇振摇提取时，采用分液漏斗，每次至少30 min，分离液体速度要慢；（3）用D101型大孔吸附树脂柱洗脱时，洗脱过程要保持慢速，保证前一种洗脱液完全流出时再加入另一种洗脱液；（4）对氨试液及1% NaOH溶液的去杂效果进行了试验比较，通过处理后样品比较及色谱分析，结果表明，1% NaOH溶液能更好地去除样品中黄酮等含酚羟基等酸性杂质，洗涤效果更好。

2.2 色谱条件的确定

2.2.1 色谱柱

比较了Agilent SB-C18柱、Agilent TC-C18柱和Agilent Bonus-RP柱，结果表明，采用Agilent SB-C18柱时黄芪甲苷的分离度好，而且色谱峰形尖锐对称，故实验采用Agilent SB-C18柱。

2.2.2 流动相

分别以甲醇-水(80∶20)和乙腈-水(32∶68)为流动相考察供试品溶液中各组分的分离情况。结果表明，以甲醇-水(80∶20)为流动相时，黄芪甲苷出峰慢，而且与其它组分的色谱峰不能完全分离；而以乙腈-水(32∶68)为流动相时，黄芪甲苷与其它组分分离良好。故选用乙腈-水(32∶68)为流动相。

在1.2色谱条件下，黄芪甲苷对照品溶液及样品加标溶液色谱图分别见图1、图2。由图1、图2可知，黄芪饮片样品中，黄芪甲苷与其它组分分离良好，色谱峰形尖锐对称，适于用作定量分析。

图1 黄芪甲苷标准溶液色谱图

图2 黄芪饮片样品溶液色谱图

2.3 线性方程和检出限

分别精密移取标准溶液10，20，30，40，50，60 μL，置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀释至标线，摇匀，进样20 μL，以对照品色谱峰面积的自然对数为纵坐标，以进样量的自然对数为横坐标，进行线性回归，得回归方程为y=1.544 4x+10.145 3，相关系数r2=0.999 6，结果表明，黄芪甲苷在2～12 μg/mL范围内与色谱峰面积线性关系良好。

逐步稀释黄芪甲苷标准储备液，在1.2色谱条件下进行测定，根据被测组分在气相色谱上的信噪比（S/N）为3确定检出限为1.5 μg/mL；以信噪比10计算定量限，结果为7.5 μg/mL。

2.4 精密度试验

将黄芪饮片溶液，连续进样6针，黄芪甲苷色谱峰面积测定结果见表1。由表1可知，色谱峰面积测定结果的相对标准偏差为0.65%，表明本方法精密度良好。

表1 色谱峰面积测定结果

2.5 加标回收试验

精密称定黄芪饮片9份，根据1.3.2配制样品溶液，精确加入黄芪甲苷对照品溶液0.8，1.0，1.2 mL各3份，用甲醇稀释至标线，摇匀，作为样品溶液，依法测定，计算加标回收率，结果见表2。由表2可知，黄芪甲苷的平均回收率为99.6%，表明本法准确度较高。

表2 加标回收试验结果

3 结语

采用蒸发光散射高效液相色谱法测定黄芪饮片中黄芪甲苷的含量，具有良好的准确性和重现性，可用于黄芪及其制剂中黄芪甲苷的含量分析。

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Determination of Astragaloside Ⅳ in Astragalus Decoction Pieces by HPLC-ELSD

Xun Qining, Hou Qianqian, Liu Zhijuan, Xu Feng, Zhang Wenshen, Liu Xia, Ji Kejian
（CNGC Institute53, Jinan 250031, China）

HPLC-ELSD method was used to determine astragaloside Ⅳ in astraglus decoction pieces. The sample of astragalous decoction pieces was extracted by methanol andn-butyl alchol, after cleaning with NaOH solution, the sample was dried and disolved in methanol, and was determined by Agilent SB-C18column (250 mm×4.6 mm, 5μm), acetonitrile-water(32∶68) was as the mobile with the flow rate of 1.0 mL/min, the drifttube temperature was 80℃. The detection limit of the method was 1.5 μg/mL. The linear range was 2-12 μg/mL(r2=0.999 6). The RSD of determination results was 0.65%(n=6). The average recovery of astragaloside Ⅳ was 99.6%. This method is accurate, reliable and with good reproducibility, and it can be used for the determination of astragaloside Ⅳ in Radix Astragali and its products.

astragalous decoction pieces;astragaloside IV; HPLC; ELSD

O657.7

：A

：1008-6145(2015)05-0062-03

10.3969/j.issn.1008-6145.2015.05.016

联系人：侯倩倩；E-mail: houqianqian53@163.com

2015-08-04