连续流动注射法同时测定海水中的硝酸盐和亚硝酸盐

朱敬萍，胡红美，张小军，顾蓓乔，梅光明，严忠雍

（1.浙江海洋学院海洋与渔业研究所，浙江省海洋水产研究所，浙江省海洋渔业资源可持续利用技术研究重点实验室，浙江舟山 316021）

海水中亚硝酸盐和硝酸盐是无机氮的主要存在形式，是一种重要生源要素，也是引起近岸海域水体富营养化的主要因素，其含量为海洋科学研究中的一项基本数据。目前，硝酸盐和亚硝酸盐的测定方法有很多[1-3]，如紫外可见分光光度法[4-5]、高效液相色谱法[6-7]、毛细管电泳法[8]、离子色谱法[9]、离子选择电极法[10]、流动注射法[11-16]等。分光光度法操作步骤冗长、繁琐耗时又耗化学试剂，不能满足批量样品的快速测定，难以对水体进行实时监测；离子选择电极法仪器设备简单，且能进行连续快速测定，但灵敏度较低；其他方法其仪器昂贵，实验成本较高，在进行大批量样品测试时显得费时费力和增加成本，并且对环境造成一定的污染。近年来连续流动注射技术被越来越多地应用于海水中营养盐的分析，AA3流动注射仪以其模块化设计，具有自动进样、分析速度快、直接输出样品浓度而不需以吸光度转换、测定成本低等优点，正在日益得到推广。本文运用SEAL Analytical AA3流动注射分析仪，同时测定海水中的硝酸盐和亚硝酸盐，可在1 h内完成60个样品中这两个参数的连续测定，并能按照各种形式表达输出检测结果，具有灵敏度高、准确性好等优点。

1 材料与方法

1.1 样品采集与预处理

分别于2014年2月、5月、8月、11月四个季度，在长江口、杭州湾、舟山渔场等海域各进行一次海水样品的采集，水样带回实验室后，经0.45 μm滤膜过滤后贮于聚乙烯瓶中保存备用。应从速分析，如不能从速分析，需放置冷藏室保存。

1.2 方法原理

硝酸盐测定原理[21]：在铜的催化作用下，硝酸盐被镉圈还原成亚硝酸盐，并和对氨基苯磺酰胺及盐酸萘乙二胺(NEDD)反应生成粉红色化合物在550 nm波长下检测。

通常情况下，水和海水中氧化剂和还原剂的浓度及金属离子的浓度都很低，不足以引起干扰。如果金属离子浓度高，会使得测量值偏大，如二价汞和二价铜会形成有颜色的络合离子，增加光的吸收。硫化物，硫酸盐和有机物，尤其是油，会影响镉圈的还原能力，产生干扰。含有这些物质的样品在测定前必须预处理。该方法也适用于过硫酸盐消化后样品的测定。样品通过镀铜的镉圈还原，在缓冲溶液中硝酸盐被还原为亚硝酸盐。其吸光值与样品中的亚硝酸盐+硝酸盐浓度呈线性关系。硝酸盐浓度通过从亚硝酸盐+硝酸盐浓度中减去亚硝酸盐浓度获得。

亚硝酸盐测定方法原理：亚硝酸盐在酸性条件下与对氨基苯磺酰胺反应生成一个偶氮化合物，然后与萘乙二胺盐酸（NEDD）反应生成紫红色化合物在550 nm波长下检测。

亚硝酸盐浓度是在没有通过镉柱的程序中测定的。本方法不存在明显的盐误差。

1.3 主要仪器和试剂

BRAN+LUEBBE连续流动分析仪AutoAnalyzer3（德国布朗卢比公司）。LED光度计。实验室常用仪器和器皿。

硝酸盐标准储备液：100 mg/L-N(中国计量科学研究院，国家标准物质)。配制成10.0 mg/L-N硝酸盐标准使用液。

咪唑缓冲液：6.0 g咪唑加入1.0 mL硫酸，用纯水稀释至1 000 mL冷藏。

显色剂：将100 mL磷酸加入约700 mL纯水中，加入10.0 g磺胺，完全溶解后，再加入0.50 g盐酸萘乙二胺（NEDD）和4 mL Brij-35,30%溶液（活性剂），用纯水稀释至1000 mL，并混合均匀。试剂必须无色，储存于棕色瓶中，冷藏。

亚硝酸盐标准储备液：100 mg/L-N(中国计量科学研究院，国家标准物质)。配制成5.0 mg/L-N亚硝酸盐标准使用液。

显色剂：与测定硝酸盐使用的显色剂相同。测定前所有试剂均需超声脱气。

所有试剂均为分析纯。实验用水为去离子水（18.2 MΩ·cm）。

1.4 仪器工作条件

仪器工作条件的设定见表1。

表1 仪器工作条件Tab.1 Working conditions of Instrument

启动AA3流动分析仪，泵入纯水至基线稳定后，插上加热池(37℃)电源，再泵入试剂到进样通道，达到试剂基线稳定；测定样品前，要先测一下标准曲线中标准浓度的最高点，最佳峰高为75%～95%之间，设定它的增益点。然后开始自动分析。实际操作中因该模块中的硝酸盐和亚硝酸盐两个通道同时运行，故设置进样速率应一致，均设置为60个/h。启动工作程序,仪器自动取样并进行分析，分析全部完毕后电脑自动输出各水样和标准系列的浓度值。流动注射分析仪硝酸盐和亚硝酸盐分析模块流路见图1。

图1 硝酸盐和亚硝酸盐分析模块流路图Fig.1 Analysis module flow chart of nitrate and nitrite

2 结果与讨论

2.1 管路流通状态对检测灵敏度的影响

一般来说，我们可以把影响一个具体分析过程的因素分为两大类，液流的流体状态、显色与检测。AA3高性能的蠕动泵为液流的均匀、稳定提供了保证，可以进行准确的流量控制和保证稳定持续向前的推动力，可以有效地消除流体的脉动。泵、化学模块、检测器位于同一水平面上，没有高度差，不会带来压降。此外，流体状态还受空气泡大小、形状影响。空气泡大小要合适，太大流速过快，进入流通池中的流量相对减少；太小不能完全分割样品，带过增加。气泡形状要圆头圆尾，否则管路中易产生负压。此外，废液管太长，或伸入废液液面下也会产生负压，导致乱峰和杂峰，影响线性；取样针、试剂管路、接头之间内径差异大，也会产生负压。因此选择最佳的管路对检测灵敏度非常重要。

连续流动化学分析是采用并流技术，通过泵管定量吸取各种试剂与样品，按照确定的比例关系，发生显色反应，按照朗伯比尔定律对样品定量测定。加入空气泡使样品或标准系列溶液分割，并使液流处于完全湍流状态，确保提高测定过程的灵敏度。

2.2 镉柱与镉圈的优化选择

硝酸盐的检测通常需通过镉柱来还原[11-12,17]，AA3流动分析仪的镉柱需自己动手填装，根据镉颗粒和空隙的大小，可以通过使用不同的管子调节镉的表面积。当柱子的直径是最大颗粒的两倍时，分散率最低。需要调整管子的长度保证硝酸盐可以被完全还原。管子太长或有死体积会引起高的带过，且在反复检测海水样品过程中容易降低还原率，需重新填装镉柱和清洗并激活。但镉有毒，由于填装镉柱操作时有许多不便，容易使皮肤接触和吸入。因此本实验采用镉圈代替镉柱，镉圈无需重新填装，清洗、激活方便可行。此外，选择镉圈，可降低基线噪音和检出限[15]。为更好地延长镉圈的使用寿命，把分割片断流的空气替换为氮气。为稳定隔圈，分析样品前，分别泵入100 mg/L的硝酸盐标准储备液5 min，再泵入100 mg/L的亚硝酸盐标准储备液10 min。等100 mg/L的硝酸盐标准溶液完全冲洗干净后，再泵入标准曲线最高浓度的硝酸盐标准溶液直到出现的峰平稳（约10 min）。

2.3 试剂浓度的优化选择

为确保良好的重现性和低检出限，保证反应环境的小变化不会影响结果，需通过实验来调整试剂的浓度。测定硝酸盐时，多数文献报道采用氯化铵缓冲液，但试剂和溶液中活性氯与铵离子的来源均不稳定，容易导致灵敏度降低、线性不好、背景值增大，经过反复试验氯化铵缓冲液改为咪唑缓冲液。30%的Brij-35溶液，使用时间太长易被氧化，会导致峰形不好、回收率下降，若将其加入咪唑缓冲液时对隔圈有损，会直接影响灵敏度和线性。因此，将30%的Brij-35溶液加入显色剂溶液中，且测定亚硝酸盐中的显色剂与测定硝酸盐中的显色剂浓度相同，可以共用。显色剂中磷酸用量对光电压同样影响很大，本实验在1 L显色剂中分别加入磷酸50、60、70、80、90、100、110 mL，结果表明随着磷酸用量的增加，吸光度值呈上升趋势，100 mL时吸光度值达到最大，进一步增加磷酸用量，吸光度值下降很快。因此，最终选用100 mL磷酸。

2.4 标准曲线的线性回归方程、相关系数、检出限

分别取适量的硝酸盐和亚硝酸盐标准使用液，分别配制成硝酸盐0.0～1.60 mg/L，亚硝酸盐0.0～0.150 mg/L的标准工作液，分别按照样品分析的相同条件进行自动进样分析，测得标准曲线。根据三倍信噪比测得各分析物的检测限。各组分的线性回归方程，相关系数，检出限见表2。

表2 本方法的线性回归方程，相关系数和检出限Tab.2 Linear regression equation,correlation coefficient and detection limit(S/N=3)of the proposed method

2.5 方法的准确度和精密度分析

对国家标准物质样品硝酸盐GSBZ 50008-88和亚硝酸盐GSBZ 50006-88，同时用分光光度法和流动注射法进行6次平行测定，检测结果见表3。

表3 国家标准物质样品硝酸盐和亚硝酸盐测定结果Tab.3 Results of the national standard samples of nitrate and nitrite

由表3可知，分光光度法和流动注射法测定硝酸盐和亚硝酸盐准物质，均在标准值范围内，硝酸盐分光光度法的相对标准偏差在1.25%～1.38%之间，流动注射法测得的相对标准偏差在0.762%～0.821%之间，RSD<2%。亚硝酸盐分光光度法的相对标准偏差在1.06%～1.23%之间，流动注射法测得的相对标准偏差在1.23%～1.27%之间，RSD＜2%，由此可见分光光度法与流动注射法均具有较好的精密度和准确度，符合分析要求。

2.6 实际海水样品分析及加标回收率实验

在优化条件下反应，按照实验方法测定硝酸盐和亚硝酸盐含量，本文对长江口、杭州湾、舟山渔场等海域采集水样，将水样过滤后直接进样分析，平行测定6次，同时对各站位样品进行加标回收率实验，分析结果见表4。

由表4可知，AA3流动注射分析仪测定海水中的硝酸盐和亚硝酸盐，其加标回收率分别在84.67%～101.2%之间和86.67%～100.0%之间；相对标准偏差分别在0.067%～5.27%和0.00%～4.35%，具有较好的准确度。相对标准偏差均≤6.0%，根据《海洋监测规范》要求RSD≤10%18]。结果表明，该方法有较好的精密度，符合国标的检测要求。

3 小结

本研究采用AA3流动注射分析仪同时测定海水中的硝酸盐和亚硝酸盐，选择最佳优化条件，建立最佳测定方法。硝酸盐和亚硝酸盐分别在0.0～1.60 mg/L和0.0～0.150 mg/L内呈线性关系，相关系数均大于0.999。本方法具有灵敏度高、检出限低、精密度和准确度较好的特点，各项技术指标均符合《海洋监测规范》的要求。同时，本方法摒弃了传统手工分析方法操作繁琐、耗时、耗费大量化学试剂、易引入人为误差等弊端，实现了海水中硝酸盐和亚硝酸盐的自动化分析，提高了工作效率，降低了分析人员的工作强度，特别适合大批量的样品分析，为海洋环境监测工作者提供了一种可靠而简便的水质监测方法。

表4 样品分析结果Tab.4 Results of the samples

[1]廖京勇.水体中硝酸盐和亚硝酸盐检测方法综述[J].广东化工,2010,37(5):304-306.

[2]蒋和梅,杨东静,陈姝娟,等.流动注射法在线同时测定水中硝酸盐氮和亚硝酸盐氮[J].皮革科学与工程,2012,22(5):73-77.

[3]张翠芬.食品添加剂硝酸盐、亚硝酸盐检测方法研究进展[J].中国食品添加剂,2014(6):152-155.

[4]孙 艳.紫外可见分光光度法测定食品中亚硝酸盐含量[J].天津职业院校联合学报,2014,16(5):53-56.

[5]王洪亮,任国兴,马 然,等.UV-VIS现场测定海水中硝酸盐和亚硝酸盐研究进展[J].环境科学与技术,2010,S2:372-374.

[6]沈志武,靳 艺,石飞云.高效液相色谱法同时测定牛乳及乳粉中硝酸盐、亚硝酸盐和硫氰酸盐 [J].中国卫生检验杂志,2013,23(15):3 035-3 037.

[7]战旭梅,刘 靖,刘 萍.高效液相色谱法测定香肠中亚硝酸盐含量[J].食品与机械,2014,30(6):72-74.

[8]李 珊.某些农药残留及硝酸盐、亚硝酸盐的毛细管电泳和电化学分析研究[D].福州:福州大学,2003.

[9]王 丽,艾颖超,杨 蕾.离子色谱法检测水产品中的硝酸盐与亚硝酸盐[J].中国食品学报,2014,14(3):177-181.

[10]白文林.应用离子选择电极测定水中硝酸盐[J].环境科学丛刊,1980,1(10):54-56.

[11]赵 萍,陈金辉,肖靖泽.在线镉柱还原-流动注射光度法测定食品中硝酸盐/亚硝酸盐氮[J].食品科技,2007,32(9):189-192.

[12]赵 萍,陈金辉,肖靖泽.在线镉柱还原-流动注射分析法测定水中硝酸盐/亚硝酸盐氮[J].生命科学仪器,2007,5(6):19-22.

[13]王书民,雪 梅,王宪生,等.流动注射化学发光法测定亚硝酸盐[J].光谱实验室,2013,30(1):262-265.

[14]孙西艳,洪陵成,笪海文,等.双流路互不干扰流动注射在线同时测定水中硝酸盐氮和亚硝酸盐氮 [J].化学分析计量,2009,18(5):30-33.

[15]孙冬梅,张新申,俞凌云,等.在线稀释-流动注射法测定水样中的硝酸盐氮[J].中国皮革,2008,13(37):30-32.

[16]韩 彬,曹 磊,郑 立,等.夹管电磁阀定量流动注射分析系统测定海水中亚硝酸盐和硝酸盐氮[J].2010,38(12):1 832-1 837.

[17]魏福祥,傅晓文,马晓珍.镉柱还原光度法测定海水中的硝酸盐氮[J].分析实验室,2011,30(7):10-13.

[18]GB 17378.4-2007海洋监测规范:第4部分海水分析[S].2007.