液相色谱－串联质谱法测定猪血浆和尿液中8种同化激素的残留

张 怡，李艳芹，赖丽虹，姬竹玲，任妙贤，方炳虎

（华南农业大学，广东广州510642）

同化激素（anabolic steroids）是一类具有环戊烷多氢菲结构的物质，常被作为蛋白同化剂滥用于畜牧生产中，以提高饲料转化率，促进动物生长［1］。该类化合物在畜禽体内残留，且在动物体内稳定，不易分解［2］。欧盟早在21世纪80年代规定禁止该类物质作为促生长剂用于动物生长，我国农业部第176号公告明确指出禁止动物饮水和饲料中添加炔诺酮等药物［3］。

国外已经对牛血浆、牛尿液、动物肌肉等基质中同化激素的检测方法进行了研究，已报道的分析方法主要有高效液相色谱法（HPLC）［4］、气相色谱－质谱法（GC－MS）［5－6］及液相色谱－串联质谱法（LC－MS／MS）［7－13］。目前，8种同化激素（睾酮、群勃龙、勃地龙、甲睾酮、炔诺酮、康力龙、丙酸睾酮、苯丙酸诺龙）在猪血浆和尿液中的多残留检测还未见报道。由于尿液采样方便，并能实现活体检测［13］，本文采用LCMS／MS对常被非法滥用在畜牧生产中8种同化激素在猪血浆和尿液中的残留进行研究，以期能建立低成本、快速、有效检测方法，为研究可食性组织与血液、尿液的动态关系建立基础。

1 材料与方法

1.1 材料

Agilent 1200高效液相色谱系统为美国安捷伦公司产品；API 4000电喷雾－串联四级杆质谱仪，配Analyst 4.1.5软件为美国应用生物系统公司产品；旋转蒸发仪显瑞士BUCHI公司产品；Milli－Q 纯水机为美国Millipore公司产品；Agilent C18 固相萃取小柱（200mg，3mL）为美国安捷伦公司产品；β－葡萄糖醛苷酶为上海安普科学仪器有限公司产品；睾酮、群勃龙、勃地龙、甲睾酮、康力龙、丙酸睾酮、炔诺酮标准品均为德国Dr.Ehrenstorfer公司产品；苯丙酸诺龙标准品为美国IL公司产品；甲酸、乙腈、甲醇均为色谱纯为德国Merk公司产品；乙酸乙酯、正己烷、无水乙醇均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制 储备液配制：分别准确称取群勃龙、甲睾酮、苯丙酸诺龙，睾酮、丙酸睾酮、勃地龙、康力龙适量置于10mL 容量瓶中，甲醇定容，配制成1mg／mL标准储备液，置－20℃密闭保存。混合标准溶液配制：分别从各激素药物的储备液中吸取1mL置于10mL容量瓶中，用甲醇定容，配制100μg／mL 混合标准溶液，－20℃密闭保存。使用时用初始流动性稀释成适宜浓度的工作液，现配现用。

1.2.2 色谱－质谱条件

1.2.2.1 色 谱 条 件 色 谱 柱：ZORBAX SB－Aq（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）；流 动 相：A 相 为1mL／L甲酸水溶液，B 相为乙腈溶液；梯度洗脱程序：0～1min，30%～55%B；1min～3min，55%B；3min～6min，55%～98%B；6min～12min，98%B；12min～12.5min，98%～30%B；12.5min～18 min，30%B。柱温：25℃；进样体积：5μL。

1.2.2.2 质谱条件 电喷雾电离（ESI），正离子扫描，多反应监测模式（MRM）；电喷雾电压（IS）5 500 V，雾化气压力（GS1）65psi，辅助器流速（GS2）60 L／min，气 帘 气 压 力（CUR）30 psi，离 子 源 温 度（TEM）550 ℃，碰撞室压力（CAD）8psi。锥孔电压、碰撞能量及定性离子对、定量离子对等参数参见表1。

表1 8种同化激素的质谱参数Table 1 MRM parameters for eight anabolic steroids

1.2.3 样品前处理 取5mL（精确至0.1mL）试样于50 mL 离心管中，加入乙酸铵缓冲液（调节试样pH5.4）和β－葡萄糖醛苷酶100μL，37℃水浴12 h。冷却至室温，加入10 mL 乙酸乙酯，涡旋混匀，超声提取10min，以6 000r／min离心10min。将上清液转移梨形瓶中，重复提取1次。合并提取液，于37 ℃水浴旋转蒸发至近干。加1 mL 乙腈溶解残渣，再加水3mL 稀释，备用。备用液经C18固相萃 取 柱 净 化（3 mL 甲 醇、3 mL 水 活 化，3 mL 100 mL／L甲醇水淋洗），抽干后，加入3mL 乙腈洗脱，37 ℃水浴下氮气缓慢吹干。加入2mL 300mL／L乙腈水溶解残渣，取1mL加入等体积的正己烷，以15 000r／min离心10min，上清液过0.22μm 滤膜，待测。

1.2.4 标准曲线的制作 空白试样按照“1.2.3”中方法处理，取适量空白上清液加入不同量的混合标准工作液，涡旋混匀，配制成1.5、2、5、10、20、50、100μg／L的基质匹配标准工作液。以待测物色谱图的峰面积为纵坐标，相应待测物质量浓度为横坐标，进行回归计算，求得直线回归方程。

1.2.5 回收率与变异系数 在2、10、50μg／L每个浓度重复5次，连续做3个批次。按照上述方法处理，计算回收率和精密度。

1.2.6 检测限与定量限的测定 取适量的标准工作液，制 得0.1、0.15、0.2、0.3、0.5、1、1.5、2、5 μg／L添加水平样品，按照“1.2.3”方法处理，样品经上机检测后。按照信噪比S／N≥3 确定检测限（LOD），信噪比S／N≥10确定定量限（LOQ）。

2 结果

2.1 液相条件

试验中采用乙腈－1mL／L 甲酸水作为流动相，可实现对8种激素类药物的分离，并且药物的峰形对称，没有拖尾现象，图1为8种同化激素混合标准溶液MRM 离子流色谱图。

2.2 线性范围与检测限

在1.5μg／L～100μg／L浓度内，各个药物基质匹配标准曲线线性关系良好（r＞0.99）。按照方法规定进行前处理，上机测定。在猪血浆和尿液中，睾酮、群勃龙、勃地龙、康力龙、甲睾酮的检测限为0.2 μg／L，丙酸睾酮、炔诺酮的检测限为0.3μg／L；除炔诺酮定量限为1.5μg／L，其他药物定量限均为1μg／L。

2.3 回收率和精密度

按照“1.2.3”方法，采用空白样品添加标准溶液进行检测，血浆中8种药物平均回收率为72.3%～92.3%，日内标准偏差（RSD）为2.2%～14.6%，日间RSD 为5.0%～12.2%。尿液中8 种药物平均回收率为71.5%～90.9%，日内RSD 为2.3%～13.7%，日间RSD 为3.2%～12.7%（表3）。

图1 8种同化激素药物的MRM 离子流图（5μg／L）Fig.1 Multiple reaction monitoring chromatograms of eight anabolic steriods（5μg／L）

表2 8种同化激素的线性方程、检测限和定量限Table 2 Matrix calibration curves，LOD and LOQ for eight steroid hormones

2.4 抽样检测

应用建立的分析方法，对30 个养殖场随机采集的60份猪血浆和尿液进行测定，其中1份血浆和尿液样品检测出含有睾酮，血浆残留量为1.94μg／L，尿液为3.50μg／L，血浆和尿液中未检出其他同化激素。结果表明，该方法可用于监控实际生产中该类激素的非法添加和残留检测。

3 讨论

3.1 MS／MS特征离子的选择

本文采用电喷雾电离，用针泵连续直接进样，对8种物质的质谱条件进行优化。在正离子模式下，8种激素都可形成稳定的［M＋H］＋准分子离子，然后进行相应的子离子全扫描，以确定MRM 参数（表1）。

表3 猪血浆和尿液中8种同化激素的回收率及精密度（n＝6）Table 3 Recoveries and precisions of eight steroids hormones in plasma and urine of swine（n＝6）

3.2 样品前处理优化

3.2.1 酶解 外源性同化激素在动物体内的代谢情况比较复杂，目前没有文献明确指出8种激素动物体内代谢过程和代谢途径。黄冬梅等［7］报道蛋白同化激素多以葡萄糖醛酸结合形态存在，因此本试验选择酶解。

3.2.2 提取液的选择 试验对比了乙醚［8］、叔丁基甲醚［9］、乙酸乙酯［10］等溶剂或混合溶液［7］的提取效果，发现用甲醇提取样品杂质较多，基质干扰较为严重；叔丁基甲醚提取时，群勃龙、炔诺酮、苯丙酸诺龙的回收率低于50%。乙酸乙酯提取时各个药物的回收率较高，且易于浓缩，最终选择乙酸乙酯作为提取液。

3.2.3 固相萃取柱的选择 考虑到尿液酶解后产物相对较多，本试验采用目前最常用的净化方式SPE净化［7－13］。由于该类物质为中等极性或者弱极性，多数文献采用HLB 和C18固相萃取小柱。Wozniak B等［11］将尿液直接通过C18固相萃取小柱和NH2固相萃取小柱富集、净化，以减少基质干扰。王旭峰等［12］将尿液直接冷冻、复溶后经MCX 小柱净化，上机检测。

本试验对比了8 种同化激素在HLB 和C18两种固相萃取小柱上吸附效果，发现各个药物在C18固相萃取柱上回收率均较高，同时考虑其成本相对较低，最终选择C18柱。

3.3 基质效应的消除

利用ESI离子源对目标物进行分析时会产生较强的基质效应，试验中采用在空白提取液中加入不同浓度的混合标准溶液，按照已定的色谱、质谱条件进行检测，与相应流动相（纯溶剂）中待测物的离子强度进行比较。结果发现8种同化激素在血浆和尿液中的响应值均比标准溶液低，存在基质抑制效应。为消除或减少基质效应，本试验采用空白基质匹配标准校正定量［13－14］。

3.4 实际样品检测

应用建立的分析方法，对30 个养殖场随机采集的60份猪血浆和尿液进行测定，其中1份血浆和尿液样品睾酮结果为阳性，血浆和尿液中未检出其他同化激素。说明该方法对监控实际生产中该类激素的非法添加有重要的意义。

本试验建立了猪血浆和尿液中睾酮、群勃龙、勃地龙、康力龙、甲睾酮、炔诺酮、丙酸睾酮及苯丙酸诺龙8种同化激素的LC－MS／MS检测方法，该方法前处理简单、方便，为监控猪生产中该类物质的非法添加使用提供一定的技术支持。

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