牛病毒性腹泻病毒抗原捕获ELISA 方法的建立

范 晴，谢芝勋，谢志勤，刘加波，庞耀珊，邓显文，谢丽基，罗思思

（广西兽医研究所广西动物疫苗和新技术重点实验室，广西南宁530001）

牛病毒性腹泻是由牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）引起的一种牛的呼吸道及繁殖障碍综合征［1］。该病可通过血液、鼻黏液、粪便等多种途径水平传播［2］。据调查该病在我国大部份地区广泛存在，病感染率高，牛群中相当一部分是BVDV 的携带者，虽然它们不表现临床症状，但终身带毒，持续排毒；该病还可以病垂直传播，当孕期的母牛感染BVDV，会引起死产，胚胎畸形，流产，或者分娩出外表正常的但持续感染的犊牛，当这些持续感染的犊牛再次接触抗原相似性BVDV 即会转变为黏膜病，出现急性脱水性腹泻，1月～2月内死亡，死亡率高达100%［3］。这些持续感染BVDV牛的是养牛业潜在的隐患，一旦发病会成巨大的经济损失［4］。

目前对该病的防控主要依靠疫苗免疫接种，并利用特异性诊断方法检测出持续感染牛，淘汰持续感染牛遂步净化牛群［5－6］。由于BVDV 可引起免疫抑制，即使感染BVDV 也不会产生相应的抗体，因此BVDV 的确诊需检测其抗原，常见的抗原检测方法有PCR、LAMP和ELISA［7－9］。但PCR 和LAMP有一定的局限性，需不断更新引物才能适应BVDV的变异（目前已知的BVDV 有15个基因）。ELISA方法操作简单，快速，一次可检测数百份样品，非常适合大规格疫情的检测。由于BVDV 仅有一种血清型，更适合于用ELSIA 进行检测。本研究利用NS3单克隆抗体为捕获抗原，建立BVDV 抗原捕获ELISA 方法，为今后BVDV 的防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

BVDV 毒 株Oregon CV24，NADL 株，BVDV标准阳性血清等均购自中国兽药监察所；牛肾细胞MDBK 为中国细胞典藏中心产品；抗BVDV NS3蛋白单克隆抗体，2个广西分离株GX－4，GX－6136由广西兽医研究所生物技术实验室分离；牛轮状病毒（Bovine rotavirus，BRV），牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV），牛分支杆菌（Mycobacterium bovis，MB），猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）由广西兽医研究所生物技术实验室保存；50 份阴性样品（经国标［10］检测后，结果为阴性的样品），45份待检临床牛粪便棉拭子样品采集自广西各地牛场；HRP－羊抗鼠IgG 为索莱宝公司产品；TMB 底物显色剂为天根公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病毒增殖 MDBK 细胞培养至单层，参考文献繁殖CV24毒株［11］。CV24接毒96h后，细胞出现典型病变，收获细胞复冻融3 次，10kg 离心10min，收集上清，用差速离心及不连续蔗糖密度梯度离心纯化病毒，按照ReeD－Muench 计算TCID50为10－6.9／0.1 mL，将纯化后的病毒无菌分装后置－70 ℃保存。

1.2.2 兔多克隆抗体的制备与纯化 纯化后的CV24细胞培养液无菌取出后与弗氏完全佐剂按1∶1的均匀混合，分3次免疫1月龄母兔，每次间隔10d，背部肢肌肉分点注射抗原2 mL／只，三免后，间隔1周心脏采血并分离血清，采用辛酸－硫酸铵法纯化血清，置于－20 ℃保存备用。

1.2.3 抗原捕获ELISA 方法的建立

1.2.3.1 包被抗体的确定 用pH 9.6的碳酸盐缓冲液分别包被1.2.2制备好的兔抗BVDV 多抗和BVDV 标准阳性血清，100μL／孔，37 ℃1h转4 ℃过夜，包被的浓度依次是1∶100、1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 600、1∶3 200、1∶6 400、1∶12 800，试验重复3次，比较两种多抗作为捕获抗体的效果，其余步骤均按ELISA 标准步骤进行操作，并设立阴性对照。

1.2.3.2 单抗使用浓度的确定 用10g／L BSA（牛血清白蛋白）作稀释剂，BVDV NS3单克隆抗体作为捕获抗体，每列按1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000稀释，设立阴性对照，采用方阵滴定法进行测定，重复试验3次，检测OD450nm 值，选择P／N值最大的一组为最佳捕获抗体浓度［10］。

1.2.3.3 酶标抗体使用浓度的确定 HRP－羊抗鼠IgG 按1∶1 000、1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000、1∶5 000 稀释进行ELSIA，重复试验3 次，检测OD450nm值，选择P／N 值最大的一组为最佳捕获抗体浓度。

1.2.3.4 阴阳性临界值的确定 用已建立的抗原捕获ELISA 检测50 份阴性临床样品，取其OD450nm的平均值¯x，进行样本OD450nm 平均值和标准差（SD）的计算。根据统计学原则，若样品的OD450nm 值＞阴性样本OD450nm 值的¯x＋3SD 时，可以在99.9%水平上判为阳性，当测结果仍大于临界值，则判定为阳性。

1.2.3.5 特异性试验 将对照病毒（BRV、IBRV、HCV）和细菌（MB）用培养物作待检样品，100μL／孔，用上述建立的ELISA 方法检测测定其OD450nm值，以评价该方法的特异性。

1.2.3.6 敏 感 性 试 验 将TCID50为10－6.9／0.1mL的CV24的细胞培养液从1∶10开始系列稀释，各个稀释度的病毒液100μL 用进行ELISA 测定，确定该方法对病毒的最低检出量。

1.2.3.7 临床样品的检测 参照国标合成引物，并进行RT－PCR 检测［10］。45份临床牛粪便棉拭子样品采集自广西各地牛场，用DMEM 培养基洗脱棉拭子，5 000r／min离心10min后取上清作为待检样品，用建立的抗原捕获ELISA 和RT－PCR 方法检测，同时检测检测NADL 株，2 个广西分离株GX－4，GX－6136。

2 结果

2.1 抗原捕获ELISA 方法的确定

根据间接ELISA 方阵试验结果，最佳的包被抗体为兔抗BVDV 多抗，浓度为1∶1 600，最佳捕获抗体浓度为1∶2 000。当包被抗体量为1∶1 600／孔，捕获抗体浓度为1∶2 000 时，阳性样品OD450nm 与阴性对照OD450nm 的比值（P／N）最高，酶标抗体最佳工作浓度为1∶4 000（表1，图1）。

图1 酶标抗体工作浓度的确定Fig.1 Determination of optimum working concentration of antibody labeled with enzyme

表1 最佳抗体包被浓度和捕获抗体浓度的确定Table 1 Determination of optimum working concentration of coating antibody and capture antibody

操作步骤确定后如下：兔抗BVDV 多抗1∶1 600包被，100μL／孔，37 ℃作用1h 后，4 ℃过夜；PBST 洗板3次；50g／L 脱脂奶封闭60min，PBST洗板3次；加待检样品（临床样品）100μL／孔，作用60min；PBST 洗板3次；加捕获抗体（NS3单抗1∶2 000稀释），100μL／孔，作用1h 后；HRP－羊抗鼠IgG 1∶4 000稀释作用60min；PBST 洗板3次；显色；最后2 mol／L 的硫酸终止反应，置酶标仪读取OD450nm 的值。

2.2 阴阳性临界值的确定

取50份阴性牛血清，用所建立的ELISA 进行检测，OD450nm 的平均值为0.327 和标准差为0.089确定其临界值为0.327＋0.89×3＝0.594，定义E2－ELISA 检测样品OD450nm≥0.319为阳性，OD450nm＜0.594为阴性。

2.3 特异性试验

建立的ELISA 方法检测BRV、IBRV、MD、HCV 测定OD450nm 值，均低于0.594，视为阴性，可见该方法特异性好，结果见表2。

表2 抗原捕获ELISA 方法特异性试验结果Table 2 The specificity test result of Ag－capture ELISA

2.4 敏感性试验

将CV24细胞培养液（10－6.9／0.1mL）从1∶10开始系列稀释进行ELISA 测定。结果表明，细胞病毒液最低检出量为7.9×103TCID50（表3）。

表3 抗原捕获ELISA 敏感性试验结果Table 3 The sensitivity test result of Ag－capture ELISA

2.5 与RT－PCR方法比较结果

用建立的抗原捕获ELISA 和RT－PCR 方法检测BVDV NADL 株，2 个 广 西 分 离 株GX－4，GX－6136，以及本实验室所保存45份临床牛粪便棉拭子（其中18份为阳性样品，27份为阴性样品），符合率为100%，结果见表4（阴性样品结果省略）。

表4 RT－PCR与抗原捕获ELISA 方法的比较Table 4 The comparing result of RT－PCR and Ag－capture ELISA

3 讨论

BVDV 感染机体后免疫系统的CD4＋T 细胞主要识别NS3和E2两种蛋白，并可诱导免疫细胞产生针这两种蛋白的抗体［12］。但囊膜蛋白E2在各个毒株中变异较大，存在两个可变区（V1、V2）［13－14］。NS3核苷酸序列分析表明，NS3 编码区不仅在BVDV 各毒株间都较保守，且在不同基因型（BVDV1和BVDV2）和生物型（细胞病变型和非细胞病变型），以及瘟病毒属中都是是非常保守的［12］。因此，本研究选择BVDV NS3的单克隆抗体作为捕获抗体。

本研究比较了BVDV 标准阳性血清和兔抗BVDV 多抗2种抗体作为包被抗的效果，结果发现，兔抗BVDV 多抗效果较好，P／N 值高，特异性好。推测BVDV 标准阳性血清中存在抗牛的某些抗体，会BVDV 抗原发生非特异性结合；另外本试验是采用蔗糖密度梯度离心纯化后的病毒免疫家兔，产生的抗体经过纯化后，纯度较好，因此特异性好。

据报道BVDV 在我国广泛在，安徽、江苏、广西各 省BVDV 感 染 率 为 分 别 为34.2%、8.4%、10%［3］。2009年－2012 年，广西地区的BVDV 感染率高达24.8%（间接ELISA 方法检出）和27.3%（荧 光 定 量RT－PCR 检 测 出）［9］。通 常 情 况 下，BVDV 是以持续性感染不发病的形式存在于牛身体内以，且BVDV 可引起免疫耐受，即使感染BVDV也不会产生相应的抗体。由前面感染的数据可见，BVDV 抗体检测率低于抗原检出率。鉴于BVDV发病机理及临床特征的复杂性，需要对其抗原的检测才能准确诊断牛是否感染了BVDV。本研究所建立的BVDV 抗原捕获ELSIA 方法一次可以检测数百个样品，特异性好，敏感性高，最低可以检测到7.9×103TCID50，操作方便，所需设备简单，数小时内可完成，可合适于大规模的检测。对牛场进行定期监测，获知全群感染水平，可初步确定BVDV 阳性感染场。在此基础上，再结合其他诊断方法，才能逐步开展BVDV 的净化，今后BVDV 的防制提供技术保障。

［1］ 殷 震，刘景华.动物病毒学报［M］.2 版.北京：科学出版社，1997：562－571.

［2］ Meyling A，Houe H，Jensen A M.Epidemiology of bovine virus diarrhoea virus［J］.Rev Sci Tech，1990（9）：75－93.

［3］ 邱昌庆，郭慧琛，程淑敏，等.安徽、江苏、广西部分地区水牛牛病毒性腹泻／粘膜病血清学监测［J］.中国预防兽医学报，2000，22（6）：453－454.

［4］ BVDV virus causes heavy losses in a Scottish cattle herd［J］.Vet Rec，2007，160（9）：281－284.

［5］ Negron M，Raizman E A，Pogranichniy R，et al.Survey on management practices related to the prevention and control of bovine viral diarrhea virus on dairy farms in Indiana，United States［J］.Prev Vet Med，2011，99（2－4）：130－135.

［6］ Walz P H，Grooms D L，Passler T，et al.Control of bovine viral diarrhea virus in ruminants［J］.J Vet Intern Med，2010，24（3）：476－486.

［7］ Qing F，Zhixun X，Liji X，et al.A reverse transcription loopmediated isothermal amplification method for rapid detection of bovine viral diarrhea virus［J］.J Viro Meth，2012，186（1－2）：43－48.

［8］ 范 晴，谢芝勋，刘加波，等.牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量RT－PCR检测方法的建立［J］.动物医学进展，2010，30（10）：10－14.

［9］ 范 晴，谢芝勋，刘加波.牛病毒性腹泻病毒三种核酸检测方法的比较［J］.中国兽医科学，2012，42（3）：294－298.

［10］ SN／T1905－2007.牛病毒性腹泻／粘膜病反转录聚合酶链反应操作规程［S］.

［11］ 王树成，林建辉，刘 宏，等.用MDBK 传代细胞繁殖BVD毒株的研究［J］.中国动物检疫，1995，12（4）：6－8.

［12］ Dirk D，Edward J D，Michael J，et al.Mapping of two antigenic domains on the NS3protein of the pestivirus bovine viral diarrhea virus［J］.Vet Microbiol，2005，108（1－2）：1322.

［13］ Marzocca M P，Seki C，Giambiagi S M，et al.Truncated E2 of bovine viral diarrhea virus（BVDV）expressed in Drosophila melanogaster cells：a candidate antigen for a BVDV ELISA［J］.J Virol Meth，2007，144（1－2）：49－56.

［14］ Ferrer F，Zoth S C，Calamante G，et al.Induction of virusneutralizing antibodies by immunization with Rachiplusia nu per os infected with a recombinant baculovirus expressing the E2glycoprotein of bovine viral diarrhea virus［J］.J Virol Meth，2007，146（1－2）：424－427.