一株重金属高耐受菌的分离及鉴定

曾奇玉， 梁丽妮， 杨永凤， 朱美娟， 苏 平

湖北师范学院生命科学学院，湖北黄石435000

一株重金属高耐受菌的分离及鉴定

曾奇玉， 梁丽妮， 杨永凤， 朱美娟， 苏 平∗

湖北师范学院生命科学学院，湖北黄石435000

利用含不同浓度的重金属选择性培养基，对采集的微生物样本进行分离，并筛选出一株超高耐受重金属菌ZM-12。对ZM-12的16S rDNA高变区序列进行BLAST比较和MEGA 4.0分析，结果通过同源进化树分析表明该菌属于肠杆菌属(Enterobacter)。对该菌进行生理生化实验、最低抑菌浓度(MIC)的测定和火焰原子吸收实验，结果表明:ZM-12属于革兰氏阴性杆菌，在不同种类的重金属培养基中，其MIC值各不相同，Cu2＋、Pb2＋、Mn2＋、Ni2＋对ZM-12的MIC值分别为22.33 mmol/L、14.48mmol/L、＞200 mmol/L、58.69mmol/L。通过火焰原子吸收的方法，测定了ZM-12对培养基中重金属的去除率，培养一定时间后，分别测定了溶液中重金属 Pb2＋、Mn2＋、Cu2＋、Ni2＋的浓度，得到其最大去除率分别达到97.68%、99.93%、41.23%、99.46%。该菌株的发现及鉴定为重金属污染环境的治理提供了参考。

重金属耐受菌；肠杆菌属；16S rDNA；最低抑菌浓度(MIC)；去除率

重金属污染来源广泛，主要包括矿冶、化工和机械制造等。由于重金属在环境中不能被降解，它会参与食物链循环并最终在生物体内积累，其对生态环境和人体健康的危害极大。近年来，人们发现可以利用某些微生物将重金属吸附或者通过微生物的作用将毒性价态的重金属转化成低毒性或无毒性价态[1]。通过人工筛选鉴定，这些微生物具有很强的适应力，能在pH和温度条件范围相对较宽的环境中正常生长，同时利用微生物去除重金属还有投资少、运行费用低、处理效率高、无二次污染等特点[2]。本实验通过对人为导致的重金属富集量较大的环境进行采样，从中筛选出一株超耐受重金属菌株 ZM-12，利用细菌16S rDNA分子鉴定法对ZM-12进行了种属鉴定，并在重金属环境中进行培养，得到ZM-12耐受重金属Pb2＋、Mn2＋、Cu2＋、Ni2＋的MIC值，并利用火焰原子吸收实验考察了ZM-12对不同种类重金属离子的去除能力，以期为重金属污染环境的修复提供参考。

1 材料和方法

1.1 主要材料与试剂

pMD18-T载体购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒为Axygen公司产品；T4 DNA Ligase为NEB公司产品；Taq酶和dNTP均为Pointbio公司产品；上、下游通用引物27F和1502F购自北京天一辉远公司。菌种ZM-12由采样分离所得。

重金属培养基[3]:准确配制含 Pb2＋、Mn2＋、Cu2＋、Ni2＋1 mol/L的重金属溶液，在超净工作台中将重金属溶液添加至LB培养基中，配制成Pb2＋(4.82～14.48 mmol/L)、Mn2＋(18.5～200 mmol/L)、Cu2＋(6.25～22.33 mmol/L)、Ni2＋(5.11～58.69 mmol/L)梯度浓度的重金属培养液。

1.2 菌体采集

湖北黄石是一个矿冶历史悠久的城市，菌体采集主要考虑人为导致的重金属富集量较大的地点，土壤样品采自来源不同的3个地方:①黄石市湖北师范学院后山采矿废水湖；②湖北师范学院化工化学学院实验废液池(有机池、无机池)；③码头矿堆废水。

1.3 菌体分离纯化

取采集的土壤样品，装入聚乙烯塑料容器，按固液比1∶10(g/mL)的比例加入无菌蒸馏水，30℃恒温震荡箱(150 r/min)培养30 min，取上清液1 mL于装有9 mL灭菌水的试管中，此为10-1浓度，再依次稀释成 10-2、10-3、10-4浓度梯度[4，5]。取10-3、10-4稀释液 0.1 mL涂布于含有3.1 mmol/L Cu2＋的固体培养基上，将平板倒置于30℃恒温培养箱培养。48 h后挑取平板上的单菌落在3.1 mmol/L Cu2＋的固体培养基上划线，37℃恒温培养箱培养，多次划线分离纯化细菌。

1.4 最低抑菌浓度(M IC)测定

将分离的单菌落接种于LB液体培养基中扩增培养(37℃，160 r/min，培养12 h)。将配制好的重金属培养基分装于试管中，再在每支试管中加入 100 mL菌液进行梯度培养(160 r/min，37℃)。培养48 h后，取5 mL菌液滴加到重金属固体培养基中涂布培养，观察是否长出菌落，以此验证最大MIC值[4]。

1.5 重金属离子去除率的测定

利用火焰原子吸收光谱仪测定重金属的离子去除率。根据仪器的可测范围(0.2～10 mg/L)，利用1%的稀硝酸溶液配制4种重金属离子的一定浓度梯度的混合标准溶液，每个浓度配制100 mL于容量瓶中定容。配制样液，在一定浓度重金属培养基(Pb2＋14.5 mmol/L、Mn2＋109.2 mmol/L、Cu2＋18.8mmol/L、Ni2＋15.3 mmol/L)中培养ZM-12，72 h后取培养液于离心管中，离心取上清，将上清液配制成可测范围内的浓度的样液。最后，通过混合标准液测定样液中4种重金属离子的浓度，即可得到ZM-12在培养过程中重金属的去除率[6]。

1.6 菌属鉴定

以细菌菌液作为PCR扩增模板，引物为细菌16S rDNA PCR通用引物:27F-5′-CGGCTACCTTGTTACGACT-3′，1502F-5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′[4]。

利用PCR扩增技术提取及扩增DNA，并采用1%的琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析。利用DNA凝胶回收试剂盒对PCR产物进行DNA回收，连接至载体pMD18-T，转化E.coli感受态DH5α细胞，转化子经PCR检测确认后，由北京天一辉远公司进行测序，序列结果通过BLAST软件进行比对分析[7]。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选与生理生化特性

利用0.2 g/L Cu2＋重金属培养基进行初次培养筛选(160 r/min，37℃，12 h)，得到7株大小形态不同的菌株，再利用0.2～1 g/L Cu2＋梯度浓度的重金属培养基对这7种菌株进行筛选(160 r/min，37℃，12 h)，结果只有一株菌株能够在1 g/L的Cu2＋重金属培养基中正常生长，将其命名为ZM-12，并经试验证实其最适生长温度为37℃，最适pH为7.2，ZM-12的最适生长温度和pH如图1所示。

图1 ZM-12最适生长温度(A)和pH(B)Fig.1 The optimum growth temperature(A)and pH(B)of ZM-12.

根据革兰氏染色(图2，彩图见图版二)观察到ZM-12为革兰氏阴性肠杆菌，并通过淀粉酶水解实验可知ZM-12能够分泌淀粉水解酶水解淀粉，最后在过氧化氢酶实验中证实ZM-12能够释放过氧化氢酶，使过氧化氢水解[7]。

图2 ZM-12的菌体形态(×1 000)Fig.2 Morphology of ZM-12 strain(×1 000).

2.2 ZM-12 16S rDNA分析

以菌ZM-12总DNA为模板，利用方法1.6得到ZM-12的16S rDNA，与载体pMD18-T过夜连接。连接产物经转化、筛选挑取单克隆，并提取得到该单克隆质粒，然后对该质粒进行PCR检测。将ZM-12的16S rDNA的PCR产物、质粒和质粒PCR检测的结果进行琼脂糖凝胶电泳检测[8，9]，可知细菌ZM-12的16S rDNA在1 500 bp左右(图3)，PCR扩增产物的条带大小和质粒的PCR检测结果都在1 500 bp左右，这表明该扩增产物是目的DNA片段[4]。

ZM-12菌的16S rDNA测序结果，利用NCBI BLAST比对ZM-12菌的16S rDNA测序结果，并在MEGA 4.0软件中构建进化树，对所测定的ZM-12及与它同源性最高的 10株细菌的16S rDNA全序列进行遗传距离计算，根据遗传距离得到系统发育树(图4)[10，11]。

图3 16S rDNA的电泳图Fig.3 The electrophoresis of 16S rDNA.

根据BLAST结果显示，ZM-12与肠杆菌属Enterobacter中的 Enterobacter cloacae及 Enterobacter ludwigii的16S rDNA序列具有99%的高度同源性，该菌株16S rDNA序列在GenBank中的序列注册号为KP984768[7]。由图4可以看出，ZM-12与肠杆菌属中的Enterobacter ludwidgii和Enterobacter cloacae进化距离近，而与Chryseobacterium进化距离较远，因此可以判断ZM-12属于肠杆菌属(Enterobacter)[12]。

2.3 最低抑菌浓度(M IC)

MIC值是指各种重金属能抑制培养液中细菌生长的最低浓度，MIC值越大，重金属对菌体的毒性越小，相反，其对菌体的毒性就越大[4]。ZM-12能够耐受Pb2＋、Mn2＋、Cu2＋、Ni2＋等多种重金属，利用方法1.4测定ZM-12对Cu2＋、Pb2＋、Mn2＋、Ni2＋耐受浓度，如表1所示。

图4 ZM-12 16S rDNA序列的无根系统发育分析树Fig.4 The rootless phylogenetic tree of ZM-12 16s rDNA sequence.

表1 ZM-12菌株的最低抑菌浓度(mmol/L)Table 1 The MIC value of ZM-12(mmol/L).

通过表1数据分析，ZM-12的MIC值明显高于现今已发现的重金属耐受菌[4，7]，4种重金属对ZM-12毒性大小:Pb2＋(14.48 mmol/L)＞Cu2＋(22.33 mmol/L)＞Ni2＋(58.69 mmol/L)＞Mn2＋(＞200 mmol/L)，即 Pb2＋对 ZM-12的菌体毒性最大[7]。

2.4 重金属离子去除率

利用方法1.5，将培养72 h后的重金属培养基取出并离心，配制成样液，根据仪器的使用范围配制浓度梯度标液。将配置好的样液和标液进行火焰原子吸收测定，得到的数据结果进行分析，得到ZM-12菌株的最大去除率[6]。

表2 ZM-12菌株的最大去除率Table 2 The removal rate of ZM-12.

对表2结果进行分析，ZM-12对这4种金属离子的去除率大小比较:Mn2＋(99.93%)＞Cu2＋(99.46%)＞Pb2＋(97.68%)＞Ni2＋(41.23%)，即ZM-12对Mn2＋和Cu2＋的去除率最大。

3 讨论

随着工业日益发展，大量重金属以工业废渣、废水、废气形式排入环境，据统计，全球每年释放到环境中的重金属高达数百万吨，并且还在逐年增加，人们对重金属环境污染的认识以及现代生物技术的发展，使微生物治理重金属污染逐渐受到重视。某些微生物对重金属的吸收、沉积、氧化和还原等作用可有效减少植物的摄入，从而降低重金属的毒性。

苏艳蓉等[4]发现某种细菌对Pb2＋和Mn2＋的耐受浓度分别达到9.66 mmol/L和27.78 mmol/L。张花香等[13]研究了金矿区蜡样芽孢杆菌对重金属离子 Cu2＋、Zn2＋、Au3＋、Ag＋的耐受性。黄峰源等[14]发现嗜酸性氧化硫硫杆菌 TS6对 Cu2＋、Cr3＋、Zn2＋、Ni2＋的浓度分别达到6.25 mmol/L、28.8 mmol/L、15.29 mmol/L和4.23 mmol/L。Hoyle和Beveridag[15]研究了枯草牙孢杆菌 (Bacillus subtilis)细胞壁上的肽聚糖，证明其可以从水溶液中络合大量的金属离子。

本实验从人工导致重金属富集量较大且富集时间较长的样地进行采集，从这类样品中分离的菌种大部分具有重金属耐受性。但是，ZM-12具有突出的重金属耐受性，其MIC值和重金属离子去除率普遍高于现今已报道的菌株[4，13，14]，重金属耐受机制可能与目前研究并报道的重金属耐受菌有所不同[15～18]。根据实验现象发现ZM-12在培养过程中可能会自发分泌CO，与Mn2＋结合并反应形成MnCO3沉淀，因此诸如Pb2＋、Mn2＋、Ca2＋等金属离子在培养过程中能与CO形成大量沉淀，使重金属离子由可溶性游离态转变为不溶性沉淀，以此达到重金属离子去除的效果。目前，本课题组正在对CO的释放现象进行基因水平的研究，从ZM-12生长发育状况和代谢水平上进行观察和验证，从而为环境中重金属污染吸附机制研究提供有益的依据。

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Isolation and Identification of a Bacterium Tolerant to High Concentration Heavy Metals

ZENG Qi-yu，LIANG Li-ni，YANG Yong-feng，ZHU Mei-juan，SU Ping∗
Life Science College，Hubei Normal University，Hubei Huangshi 435000，China

A strain that resist to heavy metals with high concentration，named ZM-12，was isolated by using selective culture medium containing different concentrations of heavymetals.It was identified as Enterobacter according to the BLAST comparison，the analysis in MEGA 4.0 and the phylogenetic tree.ZM-12 was Gram-negative by using the Gram stain test.In different heavy metalmedium，the MIC value is different.It can be tolerant of Cu2＋22.33 mmol/L，Ni2＋58.69 mmol/L，Pb2＋17.84 mmol/L and Mn2＋＞200mmol/L.The removal rate of heavy metals can be obtained by atomic absorption spectroscopy(AAS).The removal rate of Pb2＋，Mn2＋，Cu2＋，Ni2＋were 97.68%，99.93%，41.23%，99.46%，respectively.We can conclude that ZM-12 has high resistance to many different heavy metals.The isolation and identification of this strain can provide some basis for the pollution caused by heavy metals.

strain with heavy metals tolerance；Enterobacter；16S rDNA；minimum inhibitory concentration(MIC)；the removal rate

10.3969/j.issn.2095-2341.2015.05.11

2015-03-26；接受日期:2015-04-24

国家自然科学基金项目(41171045)；湖北省教育厅科学技术研究资助项目(D20092201)；湖北师范学院人才引进项目(2008F16)资助。

曾奇玉，本科生，研究方向为生物技术。E-mail:zqy0512＠qq.com。∗通信作者:苏 平，副教授，主要从事环境生物学的研究。E-mail:suping1202＠126.com