双醋瑞因与BSA相互作用的荧光光谱法研究*

高苏亚，李 华，刘小丽，张 韫，杨 筱

(1.西安医学院 药学院，陕西 西安 710021；2.西北大学 分析科学研究所，陕西 西安 710069；3.长安大学 环境科学与化工学院，陕西 西安 710054)

双醋瑞因(Diacerein，DA)属蒽醌类药物(二乙酰大黄酸，商品名为安必丁)，是一种新型白细胞介素1(IL-1)抑制剂，可显著改善骨关节炎患者的关节功能，刺激转化生长因子TGF-α的生成和软骨基质物质的形成而促进软骨修复[1-4]。目前，随着世界骨性关节炎发病率逐年上升，人们对DA的研究和需求日趋增多[5-7]。但DA与牛血清白蛋白(Bovin Serum Albumin，BSA)的相互作用研究鲜见文献报道[8-9]。因此通过荧光光谱法探讨了在模拟生理条件下DA与BSA的相互作用，为深入了解DA在体内的运输和代谢提供参考。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

BSA：相对分子质量66 500，Sigma-Aldrich Company中国上海分部，用0.1 mol/L Tris-HCl缓冲溶液[c( NaCl)=0.1 mol/L，pH=7.40]配成c(BSA)=2.0×10-4mol/L的储备液；DA：质量分数>99%，西安华萃生物技术公司，用二甲亚砜配成c(DA)=1.0×10-3mol/L的储备液，分别于4 ℃冰箱储存。其它试剂均为国产市售分析纯，实验用水为二次蒸馏水。

F-4500荧光光谱仪：日本日立公司；UV-2450紫外-可见分光光度计：日本岛津公司；TED温控仪：天津泰斯特仪器有限公司；PB-10酸度计：德国Sartorius集团。

1.2 实验方法

精密移取一定量2.0×10-5mol/L BSA溶液于一系列10 mL容量瓶中，依次加入不同体积的1.0 ×10-3mol/L DA溶液，用0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲溶液定容，混匀，恒温1 h(298、310 K)，在激发波长λex=280 nm扫描荧光光谱。保持波长差Δλ分别为15和60 nm下测定DA-BSA的同步荧光光谱，狭缝宽度均为5 nm。

2 结果与讨论

2.1 DA对BSA的荧光猝灭光谱

按“实验方法”测定 DA对BSA的荧光猝灭光谱，见图1。

由图1可见，BSA的荧光强度随DA浓度的增大而减弱，即DA对BSA荧光有猝灭，其间发生相互作用。

λ/nma～i:c(BSA )=3.0×10-6 mol/L；c(DA )=(0,1.0,2.0,3.0,6.0,9.0,12.0,24.0,48.0)×10-6 mol/L；温度T=310 K,pH=7.40图1 DA对BSA的荧光猝灭光谱

2.2 荧光猝灭常数的测定与猝灭机理的推测

药物分子对蛋白的荧光猝灭方式可分为静态猝灭和动态猝灭，二者均符合Stern-Volmer方程[8]。由DA对BSA荧光猝灭的Stern-Volmer方程及猝灭常数KSV(见表1)可知，F0/F随DA浓度(即[c])的增大而逐渐增大，呈良好的线性关系，且随着温度升高猝灭常数减小；其猝灭速率常数Kq远大于动态猝灭过程的最大速率常数2×1010L/mol·s[8]，则可推测DA对BSA的猝灭方式应是形成了基态复合物而引起的静态猝灭。

表1 DA对BSA荧光猝灭的Stern-Volmer方程及猝灭常数

2.3 采用2种方法计算DA与BSA的结合常数Kb和结合位点数n

方法Ⅰ：采用Lineweaver-Burk方程lg[(F0-F)/F]= lgKb+nlg[c]分别作298、310 K下lg[(F0-F)/F]-lg[c]的拟合曲线(见图2a和表2)。

方法Ⅱ：采用逐级配位、由总浓度代替游离浓度的改进公式lg[(F0-F)/F] =nlgKb+nlg[[c]t-n[P]t(F0-F)/F0]，利用Excel软件编程。总体思路：先令n=1，以lg[(F0-F)/F]对lg[[c]t-n[P]t(F0-F)/F0]进行线性拟合，可得到斜率n1。若拟合得到n1值与假设的n=1不相符时，则将n1值代入式中再次拟合，得斜率n2，依此往复迭代，直到在所要求的精确度下nk+1≈nk时，迭代结束。结果见图2b。

lg[c]a

lg[[c]t- n[P]t(F0-F)/F0]b图2 lg[(F0-F)/F]-lg[c]和lg[(F0-F)/F]-lg[[c]t-n[P]t(F0-F)/F0]关系图

T/K方法Ⅰ方法ⅡKb /(L·mol-1)nrKb/(L·mol-1)nr2988.983×1030.97240.99271.2849×1040.96150.99363108.116×1020.82610.99359.3108×1030.81130.9932

由图2和表2可知，2种方法的计算结果有一定的差异，这说明当药物总浓度和生物大分子的总浓度接近时，显然用假设游离浓度近似等于总浓度([c]f≈[c]t)的Lineweaver-Burk方程计算是不合适的，此时应该用方法Ⅱ计算。

2.4 DA与BSA之间作用方式的推断

当温度变化较小时，其作用过程中的焓变ΔrHm可以看作是一个常量，由热力学方程ln(Kb2/Kb1)=(1/T1-1/T2)ΔH/R和ΔG=-RTlnKb=ΔH-TΔS可计算出不同温度下DA与BSA作用过程中的热力学参数ΔrGm、ΔrHm以及ΔrSm，结果列于表3。

表3 DA与BSA 结合过程的热力学参数

由表3可知，ΔrHm< 0，ΔrGm< 0，说明DA与BSA的结合是一个放热、自发的过程；ΔrSm>0且ΔrHm<0，说明二者之间存在疏水作用和静电作用，且以静电作用为主。

2.5 DA对BSA构象的影响

保持发射波长与激发波长的差值分别为Δλ=15 nm和Δλ=60 nm，扫描DA-BSA体系的同步荧光光谱见图3，以便提供荧光功能基团色氨酸或酪氨酸附近微环境的相关信息，即蛋白微观结构的构象变化。

λ/nma

λ/nmb a～h:c(BSA )=3.0×10-6 mol/L,c(DA )=(0,1.0,2.0,3.0,6.0,9.0,12.0,24.0)×10-6 mol/L;T = 310 K,pH=7.40；a:Δλ=15 nm；b:Δλ=60 nm图3 DA-BSA的同步荧光光谱

由图3b可见，λmax红移，说明在此实验条件下，DA与BSA发生作用时，仅影响了色氨酸残基的微环境，进而说明DA结合到BSA的色氨酸残基附近，导致BSA结构松散，色氨酸残基周围的极性增加、疏水性减小。

2.6 DA与BSA之间作用距离的计算

根据Förster偶极-偶极非辐射能量转移理论[9]，当供能体(BSA)荧光发射光谱与受能体(DA)紫外吸收光谱有较多的重叠，且二者之间的距离不超过7 nm时，将会发生非辐射能量转移而使荧光猝灭。根据c(BSA)∶c(DA) =1∶1时荧光光谱与吸收光谱的重叠谱图(见图4)和非辐射能量转移相关公式[8]，得E=1-F/F0=0.232 8，图4中两光谱的重叠积分J=1.056×10-14cm3·L/mol，临界能量转移距离R0=2.57 nm，DA与BSA之间作用距离r=3.14 nm。表明DA与BSA能够发生非辐射能量转移。

λ/nmc(BSA)=c(DA)=3.0 μmol/L；T=310 K,pH=7.40图4 BSA的荧光发射光谱(a)和DA的吸收光谱(b)重叠谱图

3 结 论

采用荧光光谱法结合Excel迭代法计算了在不同温度下DA与BSA间的结合常数和相关热力学参数。结果表明，DA对BSA的荧光有静态猝灭效应，结合位点数约为1，结合常数随温度的升高而减小，相互作用力主要是疏水和静电作用；二者之间能够发生Förster非辐射能量转移，结合位点靠近BSA的色氨酸残基附近，使BSA分子的构象发生了变化。

[ 参 考 文 献 ]

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