建立以α-突触核蛋白损伤为靶点的细胞筛选模型

闫文芬, 衡 洋，邵千航，陈乃宏，苑玉和

(天然药物活性物质与功能国家重点实验室，中国医学科学院神经科学中心，中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所，北京 100050)

建立以α-突触核蛋白损伤为靶点的细胞筛选模型

闫文芬, 衡 洋，邵千航，陈乃宏，苑玉和

(天然药物活性物质与功能国家重点实验室，中国医学科学院神经科学中心，中国医学科学院、北京协和医学院药物研究所，北京 100050)

目的 建立以α-突触核蛋白损伤为靶点筛选抗帕金森病创新药物的细胞模型。方法 通过PCR方法扩增目的基因，分子克隆技术构建原核表达载体。融合载体转化至大肠杆菌诱导后表达重组α-突触核蛋白，亲和层析法纯化目的蛋白并通过蛋白免疫印迹和质谱技术进行鉴定，MTT法检测细胞存活率。结果 α-突触核蛋白基因的cDNA片段与理论分子量大小一致，并成功克隆至载体pET30a； 测序正确的融合载体转化至大肠杆菌E.Coli.BL21(DE3)。转化子经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达α-突触核蛋白，通过改变温度、IPTG浓度及宿主菌的增殖状态等条件，获得高表达菌株；宿主菌的裂解液通过亲和层析方法获得纯化的α-突触核蛋白，纯化蛋白通过与不同抗体免疫印迹结果证明为α-突触核蛋白，质谱结果显示其分子质量为15.3 ku，与理论分子质量15.5 ku基本一致。纯化的α-突触核蛋白刺激PC12细胞及原代神经元细胞后，细胞存活率明显下降，存活率的降低程度与α-突触核蛋白刺激浓度呈正相关性。结论 成功建立了以α-突触核蛋白损伤为靶点的细胞筛选模型，可用于筛选具有抗帕金森病功能的创新化合物。

α-突触核蛋白; 毒性作用；帕金森病；筛选模型；蛋白表达；药物靶点

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是常见的以运动功能障碍为主要特征的神经退行性疾病，临床常以补充左旋多巴为主的治疗，虽然能够改善PD的临床症状，但无法遏制其病理性改变。因此，研制能够延缓病理进展的抗PD创新药物对于提高人口健康水平具有重要意义。

PD缺乏有效治疗药物的主要原因是缺乏能够贴切模拟PD临床与病理变化的模型。因此，针对PD的病因及发病机制建立药物筛选模型，对于抗PD创新药物的研制具有重要意义。PD是多因素综合作用导致的疾病，除了衰老因素外，环境因素和遗传因素共同影响该病的发生与发展[1]，而且环境因素可通过影响遗传因素加剧PD的病理过程及病理改变。因此针对PD相关的遗传因素进行抗PD药物研究更具理论和实际意义。导致PD发病的遗传因素与多种基因的突变、异常表达等有关，其中α-突触核蛋白(α-synuclein,α-syn)基因做为常染色体显性基因，其基因多倍体、突变后都能够导致家族性PD的发生[2]，但具体的机制仍不清楚。鉴于α-突触核蛋白的异常改变能够影响PD的发生与发展，因此有学者提出“以α-突触核蛋白为靶点治疗PD”的学说[3]，该学说已得到许多学者的认同，而且也发现某些具有神经保护功能的化合物能够对抗α-突触核蛋白的毒性作用[4]。因此以α-突触核蛋白损伤为靶点筛选具有抗PD作用的化合物更具特异性。

最初的研究认为α-突触核蛋白主要存在细胞内，近几年的研究发现：α-突触核蛋白可释放到细胞外，而胞外的α-突触核蛋白具有类似朊蛋白的功能，能够在神经细胞之间传递信息[5]，促进神经元中路易小体的形成及神经元的死亡[6]。目前，有研究发现外源的α-突触核蛋白刺激神经细胞后，能够对神经细胞构成损伤[7]，提示可建立相应的模型进行化合物的筛选，但目前应用这种模型还很少，其主要原因是α-突触核蛋白的来源和获取受到限制。

当前市场上已有商品化的α-突触核蛋白，但其价格昂贵，如果应用商品化的α-突触核蛋白建立模型进行大规模药物筛选将会造成很大的经济负担。本研究旨在通过建立α-突触核蛋白原核表达体系，优化表达和纯化条件并完成其科学鉴定，利用纯化的α-突触核蛋白作用神经细胞，建立以α-突触核蛋白损伤为靶点的细胞筛选模型，用于抗PD创新药物的研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂NdeI和XhoI限制性内切酶及Taq酶购自TaKaRa，TRIzal购自Invitrogen；异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG)，咪唑，考马斯亮蓝R250，SDS，丙烯酰胺，N,N′-亚甲基双丙烯酰胺，Agrose购自Amersoco；His TrapTMFF 亲和层析柱购自BD公司；α-突触核蛋白标准品购自Sigma公司；所有细胞培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自Invitrogen公司；细胞培养耗材购自Corning， anti-α-synuclein购自Santa Cruz，anti-His购自Clontech，酵母粉、蛋白胨和琼脂购自Oxoid， PVDF膜购自Millipore。化学发光检测试剂购自普利莱公司，其他试剂为国产或进口分析纯试剂。

1.2 仪器ECL检测系统型号-Molecular Device, Lmax， 离心机 Sigma 16KP，基质辅助激光解吸附/飞行时间质谱仪-4800 plus， 美国ABI，酶标仪-Spectra Max190美国 MD，超声破碎仪-美国SONIC VCX 500。

1.3 细胞株和质粒PC12细胞购自医科院基础所细胞中心，载体pET30a来自Novagen。

1.4 目的基因获得与载体的构建根据GenBank中的α-突触核蛋白基因序列[gi:6806897]，设计特异性引物，以pEGFP-N1-syn质粒为模板[8]，PCR扩增目的基因，将扩增产物用NdeI和XhoI双酶切，回收酶切后的片段，与经过同样双酶切的载体pET30a按3 ∶1摩尔比混合，在T4DNA连接酶作用下于16℃连接过夜。过夜连接产物转化大肠杆菌Trans1-T1 Phage Resistant感受态细胞,涂布到含有质量浓度为50 g·L-1卡那霉素的LB平板上，于37℃培养过夜，次日，从LB平板上随机挑取菌落，接种于含有同样浓度卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃培养16 h，提取质粒，然后用NdeI/XhoI进行双酶切鉴定，酶切鉴定为阳性的质粒进行测序。

1.5 目的基因在原核系统的表达用测序正确的质粒以及空载体pET30a转化大肠杆菌Trans BL21(DE3) pLysS化学感受态细胞，随机挑取1个菌落，接种于含有质量浓度为50 g·L-1卡那霉素的LB培养基中，于37℃培养过夜，次日按照1 ∶100的比例将过夜培养物转接到5 mL含同样浓度卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃培养，当培养液OD600值达到0.2-0.8时，加入不同浓度IPTG，继续培养一段时间，10 000×g离心15 min收集菌体，取适量菌体加入PBS重悬，超声裂解，取上清作为样品，SDS-PAGE电泳分析蛋白表达情况。

1.6 蛋白的纯化将诱导表达的菌体超声破碎，离心收集上清，缓慢加到已用5倍柱体积去离子水及10倍柱体积Binding Buffer (20 mmol·L-1sodium phosphate，0.5 M NaCl, pH 7.4)平衡的His TrapTMFF 亲和层析柱上，流速控制在0.5～1.0 mL，然后用15倍柱体积的Binding Buffer 冲洗柱子，洗去杂蛋白。再分别用浓度10、20、30、40、50、60、70、80、100、250、500 mmol·L-1咪唑洗脱液竞争性梯度洗脱目的蛋白，并收集洗脱液。上述各个收集液取样处理，SDS-PAGE电泳检测蛋白的纯化情况。将含目的蛋白而不含杂蛋白的洗脱液进行浓缩，并用PBS置换Buffer后，冻存于-80℃。

1.7 SDS-PAGE电泳后染色及Western blot检测蛋白表达BCA试剂盒蛋白定量，样品蛋白加入上样缓冲液煮沸变性。然后经15%的SDS-PAGE分离，电泳结束后加入考马斯亮蓝R250染色液，固定染色1-2 h后脱色，观察蛋白的表达。样品蛋白经SDS-PAGE胶分离后转移到PVDF膜，质量浓度为30 g·L-1的BSA室温封闭2 h，加入一抗4℃过夜，TBS-Tween洗膜后加HRP标记的二抗，室温孵育2 h，加入ECL发光液，进行检测。

1.8 质谱法鉴定表达蛋白配置体积分数为0.3甲醇/0.7乙腈的溶液，用上述溶液配置体积分数为0.001的三氟乙酸，取上述三氟乙酸配置饱和芥子酸溶液为质谱用基质。去离子水配置目的蛋白，浓度为1 g·L-1，将目的蛋白和基质按照1 ∶1的体积比混匀，点样，上机检测。

1.9 细胞活力的检测细胞按5×107·L-1浓度接种于96孔版中，每孔100 μL(5 000细胞/孔)，培养24 h，加入含有浓度为5、10、20、40 μmol·L-1α-突触核蛋白的培养基处理，每组设6个复孔。培养24 h后，每孔加入10 μL MTT(质量浓度为50 mg·L-1，细胞孵育箱中培养4 h，弃培养基，加入100 μL DMSO，震荡至晶体颗粒溶解，10 min后在酶标仪上测定570 nm的吸光度(A)值。MTT法检测细胞存活率。细胞存活率/%=(实验组平均A值/对照组平均A值)×100%。

1.10原代神经元的培养 多聚赖氨酸包被培养板过夜，PBS洗两遍，将出生24 h的Sprague Dawley新生鼠，浸泡于体积分数为0.7乙醇浸泡10 s消毒，取出全脑，用手术剪将组织切成(1×1×1) mm3大小，以利于酶消化溶液的渗透，将组织块转移到50 mL离心管中，并加入适量的胰酶和DNA酶，置于37℃水浴中消化10 min，胎牛血清终止消化，用DMEM/F12培养基漂洗两次，即加入DMEM/F12培养基，混匀，4℃ 200g×5 min离心，倒去上清，再加入10～15 mL DMEM/F12，混匀，4℃ 200g×5 min离心，倒去上清，加入适量Neurbasal-A培养基，吹匀，细胞悬液过200目筛，然后过300目筛，显微镜下观察收集的细胞形态并进行计数和接种，加入质量浓度为5 mg·L-1的阿糖胞苷，培养5～6 d后开始实验。

2 结果

2.1 pET-30a-syn融合载体的成功构建PCR扩增获得的目的基因片段经凝胶电泳分离后，在500 bp附近有特异性条带，与α-突触核蛋白基因片段的理论分子量基本一致。连接后获得的转化子提取的质粒，经酶切得到分子量小于500 bp的特异条带，与PCR产物大小一致(Fig 1)，表明目的基因已成功克隆至载体。酶切阳性的克隆测序显示序列正确，可进行表达。

Fig 1 The gel picture of α-synuclein cDNA fragment digested by NdeI and XhoI endonucleases

M: Molecular weight marker DL2000; 1: cDNA fragment of α-synuclein; 2: pET30a; 3: pET30a-synuclein.

2.2 α-突触核蛋白在原核体系中的表达及鉴定将空载体pET30a与重组载体的菌体裂解提取蛋白，经SDS-PAGE电泳分离后固定、染色及脱色，结果显示与空载体组相比，在分子量约为20 ku时可见特异性蛋白条带，大小与标准品基本一致，如Fig 2A所示。为了进一步验证表达的蛋白是否为目的蛋白，利用pET30a的标签抗体anti-his以及目的蛋白特异性抗体anti-α-synuclein，通过免疫印迹检测发现，在20 ku左右有特异性的条带，如Fig 2B,C。上述结果表明，位于20 ku附近的特异性条带是目的蛋白α-突触核蛋白。

Fig 2 Expression and identification of recombinant α-synuclein

A:The recombination protein of α-synuclein expressed in E.Coli. BL21 (DE3) was separated by SDS-PAGE electrophesis and stained by Coomassie brilliant blue; B: The recombination protein of α-synuclein was separated by SDS-PAGE and immblotted with anti-His antibody; C: The recombination protein of α-synuclein was separated by SDS-PAGE and immblotted with anti-synuclein antibody. (S: standard substance obtained from Sigma; M: sample of mock vecter pET30a; R: sample of recombinant vecter pET30a-synuclein.)

2.3 表达条件的优化温度、IPTG终浓度、宿主菌的增殖状态(用OD600表示)及不同表达时间能够影响外源蛋白在原核宿主菌的表达。根据不同的培养条件，观察宿主菌中目的蛋白的表达情况。结果(Fig 3)发现：当温度为30℃、培养菌液OD600值为0.2、IPTG终浓度为0.4 mmol·L-1时、诱导时间为7 h、目的蛋白的表达量最多，因此将此优化条件确定为α-突触核蛋白的表达条件。

2.4 纯化条件的优化将诱导表达的菌体超声裂解破碎，离心收集上清，加到已用磷酸盐缓冲液平衡的HisTrapTMFF上，让其自然通过柱子，然后用含不同浓度咪唑的磷酸盐缓冲液进行梯度洗脱，收集各洗脱液进行SDS-PAGE检测，如Fig 4 A，采用20及40 mmol·L-1咪唑分阶段洗涤，250 mmol·L-1咪唑洗脱目的蛋白；大量样品经电泳分离后染色，并未发现更多的杂蛋白，如Fig 4 B，图片经灰度扫描后显示，目的蛋白纯度约为86%。

2.5 质谱进一步鉴定重组蛋白为了进一步明确纯化蛋白是否为α-突触核蛋白，将纯化蛋白进行质谱检测，质谱检测结果Fig 5 A显示商品化标准品的分子量为16.408 ku，Fig 5B显示目的蛋白分子量为15.34 ku，与理论分子质量15.52 ku基本一致，由此表明，该目的蛋白为α-突触核蛋白。

Fig 3 Optimization of expression condition about recombinant α-synuclein

A: Expression of recombinant α-synuclein was induced by different concentrations of IPTG. M: Protein marker,1: Before induction, 2: 0, 3: 1×10-4mol·L-1IPTG; 4: 2×10-4mol·L-1IPTG[5: 3×10-4mol·L-1IPTG; 6: 4×10-4mol·L-1IPTG; 7: 5×10-4mol·L-1IPTG; 8: 6×10-4mol·L-1IPTG; 9: 7×10-4mol·L-1; 10: 8×10-4mol·L-1IPTG; 11: 9×10-4mol·L-1; 12: 10×10-4mol·L-1IPTG; B: Recombinant α-synuclein was expressed in E.Coli. BL21 (DE3) of different propagating state evaluated by their optical density (OD600). M: Protein marker; 1:before induction; 2: α-synuclein from Sigma 3:OD600=0.1; 4：OD600=0.2; 5：OD600=0.4; 6：OD600=0.6; 7：OD600=0.8; 8：OD600=1.0. C: Recombinant α-synuclein was expressed in E.Coli. BL21 (DE3) at differents temperature induced by 4×10-4mol·L-1IPTG. M:Protein marker; 1:before induction; 2：16 ℃；3: 20 ℃；4: 25 ℃；5: 28 ℃；6: 30 ℃；7: 37℃. D: Recombinant α-synuclein was induced by 4×10-4mol·L-1IPTG for different times. M: Protein marker; 1:berore induction; 2: 0 h; 3: 1 h; 4: 3 h; 5: 5 h; 6: 7 h; 7: 9 h; 8: 11 h; 9: 20 h.

Fig 4 Optimization of purification condition eluting the recombinant α-synuclein with different imidazole by His TrapTM FF column

A: The recombinant α-synuclein was eluted from different concentration of imidazole. M: Protein marker; 1: 0; 2: 10 mmol·L-13: 20 mmol·L-14: 30 mmol·L-15: 40 mmol·L-16: 50 mmol·L-17: 60 mmol·L-18: 70 mmol·L-19: 80 mmol·L-110: 100 mmol·L-111: 250 mmol·L-112: 500 mmol·L-1. B: The purified α-synuclein was separated by SDS-PAGE gel. M: Protein marker; 1：0.5 μg; 2: 1 μg；3: 2μg; 4: 4μg; 5: 6μg; 6: 8μg; 7: 10 μg; 8:12 μg; 9: 14 μg; 10: 16 μg; 11: 18 μg; 12: 20 μg; 13: 40μg. Arrowhead points to the protein strand of α-synuclein.

Fig 5 Mass spectrum of α-synuclein

A: α-synuclein from Sigma; B: The purified α-synuclein.

2.6 α-突触核蛋白抑制细胞存活率α-突触核蛋白可直接对神经元产生损伤，因此本研究将不同浓度的α-突触核蛋白与PC12细胞或原代神经元共同孵育，通过MTT法检测细胞活力。结果Fig 6A显示，α-突触核蛋白浓度为5 μmol·L-1时，PC12细胞存活率已经开始减弱，浓度为10、20、40 μmol·L-1时，随着浓度的增加，α-突触核蛋白对PC12的损伤也越来越明显，呈一定的剂量依赖性。Fig 6B显示，α-突触核蛋白与原代神经元共孵育时，对原代神经元的损伤也具有剂量依赖性，并具有统计学意义。

3 讨论

α-突触核蛋白是由140个氨基酸组成的小分子蛋白，目前生理功能仍不清楚。有研究表明，在生理状态下，α-突触核蛋白能够参与神经递质的释放，并与囊泡的转运有关。研究表明，α-突触核蛋白无论是过表达、突变还是发生异常修饰，都能够造成神经元的损伤或神经退行性改变[9]，但具体的作用机制仍需进一步研究。

近来研究发现，细胞外异常的α-突触核蛋白能够影响神经元的功能[6]或毒性作用[10]。研究发现细胞外的α-突触核蛋白不仅能够促进路易小体的形成[11]，同时也能够诱导胶质细胞的激活，促进神经炎症的发生[12]，从而进一步加剧神经元的损伤。胞外的α-突触核蛋白能够通过多种方式发挥毒性作用，如自身形成离子通道激活钾离子通道；降低胞质膜中胆固醇的含量，改变脂筏中离子通道的分布，从而影响多巴胺的释放[13]；其最终的其毒性机制都可能与促进细胞内氧化和硝基化应激有关[14]。

Fig 6 Toxic effect of recombinant α-synuclein

A: Effects of purified α-synuclein decreased the viability of PC12 cells. B: Effects of purified α-synuclein decreased the viability of primary cells. Results were repeated 3 times.**P<0.01vscontrol.

研究证明，胞外的α-突触核蛋白与神经细胞的功能相互影响，在神经元功能紊乱时促进α-突触核蛋白释放到胞外[15]，因此胞外的α-突触核蛋白可做为疾病进展的标志物，而研究细胞外α-突触核蛋白的作用能够为阐明PD的发病机制提供更多的理论线索。本研究将α-突触核蛋白与神经细胞共孵育，模拟中枢神经系统细胞外的α-突触核蛋白对神经元的作用模式，在某种程度上可模拟PD发病过程的某一环节，有利于研究胞外的α-突触核蛋白对神经元的毒性机制。基于此建立α-突触核蛋白损伤神经元的细胞模型，可进行抗PD创新药物的研究，对抗帕金森创新药物的筛选以及作用机制的研究具有重要意义。

模型的建立，需要大量的α-突触核蛋白。为了获得大量的人源性α-突触核蛋白，研究中首先通过分子克隆技术成功构建了α-突触核蛋白原核表达载体，鉴定成功后进行诱导表达，并优化表达和纯化条件，可为后续标准操作程序的建立提供依据。获得的蛋白结果通过电泳、蛋白免疫印迹和质谱技术，确认α-突触核蛋白的正确表达并且纯度超过86%，为模型的建立提供了物质保障。目前体外筛选抗PD化合物还主要是通过评价细胞存活率的方法进行筛选，通过将α-突触核蛋白与类神经细胞PC12及原代神经元共孵育，结果发现，α-突触核蛋白能够直接导致上述细胞存活率明显下降，由此可根据细胞存活率的改变筛选到具有抗α-突触核蛋白损伤的活性化合物，这些活性化合物将对治疗PD更具有特异性。

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Construction of cell model targeted on the damage by α-synuclein

YAN Wen-fen, HENG Yang, SHAO Qian-hang, CHEN Nai-hong, YUAN Yu-he

(StateKeyLaboratoryofBioactiveSubstancesandFunctionsofNaturalMedicines,InstituteofMateriaMedica,NeuroscienceCenter,ChineseAcademyofMedicalSciencesandPekingUnionMedicalCollege,Beijing100050,China)

Aim To construct the cell model targeted on the damage by α-synuclein for screening anti-Parkinson’s Disease (PD) compounds. Methods The cDNA fragment of α-synuclein gene was obtained by PCR methods and inserted into the recombinant prokaryotic plasmid by molecular cloning technique. The recombinant plasmid was transformed into Escherichia coli, and subsequently induced to express α-synuclein protein. The recombinant α-synuclein was purified and identified by affinity chromatography, immunoblotting and mass spectrometry. The cells damage by α-synuclein was evaluated through cell viability measured by 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide. Results The obtained cDNA fragment of α-synuclein in accordance with its theoretic molecular weight was cloned into pET30a plasmid and verified by sequencing. The recombinant plasmid was transformed into bacteria E.Coli.BL21 (DE3) and induced to express α-synuclein by isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). The expression condition was optimized according to the culture temperature, the concentration of IPTG and the proliferation state of bacteria. The purified α-synuclein was proved to be a 15.3 ku molecule weight protein, and could be immunoblotted with anti-α-synuclein antibody. The purified α-synuclein could decrease the viability of PC12 cells and primary neurons significantly, and its effect was in a concentration-dependent manner. Conclusion We have succeeded in constructing the cell model targeted on the damage by α-synuclein.

α-synuclein; toxic damage; Parkinson’s Disease; screen model; protein expression; drug target

时间：2015-3-16 15:41 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20150316.1541.029.html

2014-11-03,

2015-02-15

国家自然科学基金资助项目(No 81274122，81102831, 81373997)；北京市自然科学基金(No 7131013)；教育部博士点基金(No 20121106130001)

闫文芬(1990-)，女，硕士生，研究方向：神经药理学，Tel: 010-63165182, Fax：010-63165177, E-mail: yanwenfen@imm.ac.cn; 苑玉和(1971-)，女，博士，副研究员，研究方向：神经药理学，通讯作者,Tel: 010-63165182, Fax：010-63165177, E-mail: yuanyuhe@imm.ac.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2015.04.029

A

1001-1978(2015)04-0586-05

R341；R329.25；R394.2；R745.702；R965.1；R977.6