咪达唑仑对hERG钾通道的作用*

韩圣娜， 王 沛， 张 卫， 张莉蓉△

(1. 郑州大学基础医学院药理学教研室， 2. 郑州大学药学院， 河南 郑州 450001； 3. 郑州大学第一附属医院麻醉科， 河南 郑州 450052)



咪达唑仑对hERG钾通道的作用*

韩圣娜1， 王 沛2， 张 卫3， 张莉蓉1△

(1. 郑州大学基础医学院药理学教研室， 2. 郑州大学药学院， 河南 郑州 450001； 3. 郑州大学第一附属医院麻醉科， 河南 郑州 450052)

目的：观察咪达唑仑对人胚肾上皮细胞(HEK-293)中异源表达的人类相关基因(hERG)钾电流作用及其机制。方法：利用全细胞膜片钳技术，观察咪达唑仑对hERG钾通道的抑制作用，分析其对通道激活、失活动力学过程的影响以及咪达唑仑对Y652A和F656C突变型hERG钾通道的作用。结果：咪达唑仑浓度依赖性地抑制hERG钾电流，其IC50值为(1.31±0.32)μmol/L。1.0 μmol/L的咪达唑仑加药前后半数激活电压V1/2由(2.32±0.38)mV变为(-1.96±0.83)mV；加药前后半数失活电压V1/2由(-49.25±0.69)mV变为(-57.53±0.53)mV(P<0.05)，失活曲线左移；与野生型(WT)比较，Y652A和F656C突变型可显著减弱咪达唑仑对hERG通道的阻断作用。结论：咪达唑仑能阻断hERG钾通道，失活速度加快，Y652和F656可能是咪达唑仑与hERG钾通道结合的关键位点。

咪达唑仑； hERG钾通道；全细胞膜片钳；HEK-293细胞

心律失常是围手术期常见的一种心血管并发症，是导致患者死亡的重要因素之一。其中围手术期出现QT间期延长，诱发药源性长QT综合征(long QT syndrome，LQTS)，尖端扭转型室性心动过速(torsade de pointes，TdP)，甚至猝死等，均增加麻醉和手术的风险，引起临床麻醉医生的高度重视[1,2]。临床上多种药物通过抑制由人类相关基因(human ether-a-go-go,hERG)编码的快速激活延迟整流钾通道(rapid activating delayed rectifier K+channel，IKr)，引起心肌动作电位复极3期K+外流减少，造成QT间期延长[3-5]。

咪达唑仑是一种快速和相对短效的苯二氮卓类药物，具有良好的镇静、催眠、顺行性遗忘、抗焦虑、抗惊厥的作用，常作为全麻术前和诱导用药。在临床工作中发现少数病例使用咪达唑仑后出现心率轻度增快，血压轻度下降，说明其对心血管系统有轻微抑制作用[6,7]。

本课题采用全细胞膜片钳技术观察咪达唑仑对人胚肾上皮细胞(human embryonic kidney cells，HEK-293)上异源表达的hERG钾电流的影响及其机制，初步探讨咪达唑仑的心血管不良反应，从而为围术期合理用药提供理论依据，减少围术期心脏不良反应的发生率。

1 材料与方法

1.1 质粒

编码IKr的hERG基因的真核细胞表达载体pcgi-EGFP-hERG由张朝教授馈赠(南京师范大学生命科学院)。pcgi-Y652A-hERG(酪氨酸突变为丙氨酸)和pcgi-F656C-hERG突变体(苯丙氨酸突变为半胱氨酸)由本实验室经PCR定点突变技术而得并保存。

1.2 药品和试剂

高糖DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自Gibico公司；LipofectamineTM2000购自Invitrogene公司，其他试剂均为国产分析纯。咪达唑仑购自北京汇智泰康生物技术有限公司(纯度99.8%)，溶于DMSO，配成10 mmol/L母液，实验时用正常台式液稀释，配成所需终浓度(DMSO在体系中的最大浓度<0.1%，不影响hERG电流的记录)[8]。

1.3 HEK-293细胞培养和转染

HEK-293细胞购自中国科学院上海生科院细胞资源中心。细胞在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，放置于37℃，5%CO2的细胞培养箱中培养。选用脂质体LipofectamineTM2000瞬时转染的方法将hERG基因表达在HEK-293细胞，转染36～48 h后取出细胞准备做全细胞膜片钳记录[9,10]。

1.4 hERG钾电流的记录

将表达有绿色荧光蛋白(EGFP)的HEK-293细胞的35 mm培养皿置于倒置显微镜的操作台上，更换为细胞外液(mmol/L)：NaCl 140，KCl 5.4，MgCl21，CaCl21.8，HEPES 10，Glucose 10，用1.0 mol/L的NaOH滴定pH至7.4。使用的微电极尖端约0.5～1 μm，充以电极内液(mmol/L)：KCl 140，MgCl21，EGTA 5，Na2ATP 5，HEPES 10，1 mol/L KOH滴定pH值至7.2，阻抗为2～5 MΩ。高阻封接形成后行串连电阻和电容电流补偿，形成全细胞记录模型。实验过程由计算机软件pulse 8.67(HEKA Elektronik，Germany)完成刺激信号的产生、反馈信号的采集以及数据分析。用电压钳模式进行刺激和记录hERG钾电流。采用累积加药的方法记录不同浓度的咪达唑仑作用5 min后对hERG钾电流的作用[9,10]。

在形成全细胞模式后，采用维持电位-80 mV，以10 mV为阶跃，施以-40 mV至+70 mV持续3 s的一系列去极化刺激，最后复极电位至-40 mV，持续2 s，采样频率0.25 kHz，刺激间隔15 s，记录hERG钾电流。

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 咪达唑仑对WT-hERG钾通道的浓度依赖性抑制作用

在大部分指令电压下咪达唑仑均可抑制hERG时间依赖性电流和尾电流(图1A)。以电压为横坐标，相应的电流值为纵坐标，得出1 μmol/L的咪达唑仑灌流前后电压-电流曲线(I-V)的变化(图1B、图1C)。

以咪达唑仑的浓度(0.001，0.01，0.1，1.0，10，30和100 μmo/L)对数为横坐标，给药前后的电流比值为纵坐标，得量-效关系曲线(图1D)。结果显示，咪达唑仑抑制WT-hERG钾通道电流的半数最大抑制浓度(half-maximum block concentrations，IC50)值为(1.31±0.32) μmol/L，Hill系数为0.24±0.02。

Fig. 1 Effects of midazolam on human ether-a-go-go-related gene (hERG) currents elicited by depolarizing voltage pulses A: Superimposed current traces elicited by 3 s depolarizing voltage pulses in 10 mV increments (upper panel) from a holding potential of -80 mV in the absence of midazolam (control, left panel) and in the presence of 1 μmol/L midazolam (right panel)；B and C: I-V relationships for (B) current measured at the end of depolarizing steps and (C) tail currents in control cells and in cells exposed to 1 μmol/L midazolam； D: Concentration-effect relationship for current inhibition by midazolam

2.2 咪达唑仑对WT-hERG钾通道激活曲线和失活曲线的影响

标准化hERG尾电流后，数据经Boltzmann sigmnidal方程拟合，可得WT-hERG的稳态激活曲线(图2A)。1 μmol/L的咪达唑仑加药前后半数激活电压V1/2由(2.32±0.38) mV变为(-1.96±0.83) mV，激活斜率k由(11.87±0.33) mV变为(14.68±0.76) mV，统计学处理无显著性差异。

稳态失活曲线的引出采用三脉冲程序的方法[10]，首先从维持电位-80 mV去极化至+20 mV，持续时间4 s，其次复极化至不同测试电压(-130～+20)mV，持续时间 20 ms，最后再去极化至+20 mV，即可引出在各个测试电压下从前一失活中恢复的通道产生的电流。

以测试电压为横坐标，相应电压下hERG钾电流与最大电流的比值为纵坐标，经Boltzmann方程拟合得稳态失活曲线(图2B)。结果显示1.0 μmol/L的咪达唑仑加药前后半数失活电压V1/2由(-49.25±0.69)mV变为(-57.53±0.53)mV，失活斜率k由(19.66±0.61)mV变为(21.45±0.46)mV(P<0.05)。

2.3 咪达唑仑对Y652A-hERG和F656C-hERG钾电流的作用

hERG钾通道在S6羧基端652、656位置上分别是芳香族氨基酸酪氨酸和苯丙氨酸，Y652和F656是许多药物与hERG钾通道相互作用的重要结合位点，为了判定咪达唑仑与这两个位点是否也有亲和力，该课题组探讨了咪达唑仑对Y652A和F656C突变体的阻滞作用。选用的咪达唑仑的浓度为10、30、100 μmol/L(超过咪达唑仑抑制WT-hERG钾通道的IC50值的7～70倍)。

图3A比较了10 μmol/L的咪达唑仑用于WT-hERG和Y652A-hERG钾电流的变化。图3B具体比较了三个不同浓度下咪达唑仑对WT-hERG和Y652A-hERG钾通道电流的变化。当咪达唑仑浓度分别为10、30和100 μmol/L时，其对WT-hERG钾通道分别抑制了(60.3±6.4)%、(64.0±1.3)%和(77.6±2.1)%；对Y652A-hERG钾电流分别抑制了(27.2±3.8)%、(61.9±3.3)%和(82.1±1.5)%。

由于F656C-hERG钾通道具有低细胞膜表达的特点，在正常细胞外液时不易引出外向尾电流，故实验中采用含高钾的细胞外液(95 mmol/L K+)。先给与细胞一个+20 mV的去极化脉冲，随后将细胞复极至-120 mV，引出其内向尾电流(图4A)。当咪达唑仑的浓度分别为10、30和100 μmol/L时，其对WT-hERG钾通道分别抑制了(67.1±6.9)%、(75.6±3.6)%和(81.2±4.1)%；对F656C-hERG钾通道分别抑制了(22.5±7.4)%、(31.2±5.8%)和(56.5±8.5%，图4B)。

3 讨论

各种麻醉药引起心电图QT间期异常，导致发作性晕厥、心脏猝死的心律失常时有发生。由于临床上麻醉药物多和其它药物同时使用，很难判定是麻醉药物对QT间期的单一作用[11,12]。关于咪达唑仑对QT间期影响的临床报道不多，有资料显示其对QT间期无明显影响或略有延长[13]。此外，鉴于麻醉药物对离子通道影响的复杂性，增加了在体动物研究的难度，动物实验又有其局限性，因此本实验为了解咪达唑仑对QT间期的影响及其机制，应用异源表达系统HEK-293细胞，观察其对QT间期影响的分子机制。

研究发现[14]，咪达唑仑的临床效应与血药浓度相关，40 ng/ml(约0.12 μmol/L)时开始出现效应，80 ng/ml(约0.24 μmol/L)时出现催眠作用，而该实验结果显示咪达唑仑浓度依赖性地抑制hERG钾通道，其IC50值为(1.31±0.32)μmol/L。这说明咪达唑仑在正常剂量适用范围内通常是安全的，但若超过血药浓度的5～10倍时有发生QT间期延长的潜在危险。

咪达唑仑不影响hERG钾通道激活动力学，但使稳态失活动力学曲线左移，加快了失活速度，这说明咪达唑仑可使动作电位时程的复极时间延长，可能会引起QT间期延长，是其致心律失常的主要原因。hERG钾通道在其跨膜片段S6的羧基端656、652位置上对应的是苯丙氨酸和酪氨酸，而这两个芳香族氨基酸残基(F656和Y652)已被证实与许多药物有高度的亲和力，是药物与hERG钾通道相互作用的重要结合位点[15]。如果这些位点发生突变，将会削弱药物抑制hERG钾通道的作用能力。本课题研究发现Y652和F656位点的突变削弱了咪达唑仑对hERG钾通道的阻断能力，说明Y652和F656可能是咪达唑仑阻断hERG通道的重要结合位点。

咪达唑仑是围手术期常用的较安全药物，但是根据本实验结果其仍有致QT间期延长的潜在危险，尤其是当患者围术期存在电解质紊乱(如低镁血症、低钾血症等)，心脏疾病(如心肌梗塞、严重的心力衰竭、肥厚型心肌病、严重的心动过缓、心脏瓣膜异常等)，同时使用其它易引起QT间期延长的药物，这些因素会增加咪达唑仑对hERG钾通道作用易感性。因此患者围术期出现QT间期延长，往往是多种因素相互作用的结果，作为麻醉医生我们应高度警惕引起QT间期延长的潜在因素，做全面的围术期风险评估，针对不同的患者的选择合适的药物，尽量避免心脏不良反应的发生。

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Effects of midazolam on hERG K+channel

HAN Sheng-na1, WANG Pei2, ZHANG Wei3, ZHANG Li-rong1△

(1. Department of Pharmacology, School of Medicine, 2. Department of Pharmacy, Zhengzhou University, Zhengzhou 450000;3. The First Affiliated Hospital, Zhengzhou University, Zhengzhou 450052, China)

Objective: To investigate the effect of midazolam on human ether-a-go-go (hERG) K+channels exogenously expressed in human embryonic kidney cells (HEK-293) and the underlying molecular mechanisms. Methods: Whole-cell patch clamp technique was used to record WT, Y652A and F656C hERG K+current expressed in HEK-293 cells. Results: Midazolam inhibited hERG K+current in a concentration-dependent manner, the half-maximum block concentrations(IC50)values were (1.31±0.32) μmol/L. The half-activation voltage (V1/2) were (2.32±0.38) mV for the control and (-1.96±0.83) mV for 1.0 μmol/L midazolam. The half-inactivation voltage (V1/2) was slightly shifted towards negative voltages from (-49.25±0.69) mV in control to (-57.53±0.53) mV after 1.0 μmol/L midazolam (P<0.05). Mutations in drug-binding sites (Y652A or F656C) of the hERG channel significantly attenuated the hERG current blockade by midazolam. Conclusion: Midazolam can block hERG K+channel and cause the speed of inactivation faster. Mutations in the drug-binding sites (Y652 or F656) of the hERG channel were found to attenuate hERG current blockage by midazolam.

midazolam; hERG K+channel; whole-cell patch clamp; HEK-293 cells

国家自然科学基金青年基金(81200138)

2014-09-23 【修回日期】2014-10-30△

Tel: 0371-67781855; E-mail: zhanglirongzzu@126.com

R978.1

A

1000-6834(2015)02-143-005

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.013