冠心病患者外周血中miRNA-21的表达水平及其临床意义*

杨寿娟， 张 颖, 刘 寅

(1． 天津医科大学研究生院， 天津 300070； 2. 天津市胸科医院心内科， 3. 天津市胸科医院CCU科， 天津 300222)



冠心病患者外周血中miRNA-21的表达水平及其临床意义*

杨寿娟1， 张 颖2△, 刘 寅3

(1． 天津医科大学研究生院， 天津 300070； 2. 天津市胸科医院心内科， 3. 天津市胸科医院CCU科， 天津 300222)

目的：探讨微小RNA-21(miRNA-21)在冠心病患者及冠状动脉无病变者血浆中含量的差异及其临床意义。 方法：采集冠心病患者(试验组，56例)及冠状动脉无病变者(对照组，10例)的血浆，根据诊断指南提及的症状、心电图、心肌酶、造影结果将冠心病分为心绞痛(39例)和急性心肌梗死(17例)两个亚组，提取总miRNA，运用荧光实时定量PCR (qRT-PCR)方法检测miRNA-21含量及分析miRNA-21在各组中的差异表达。测定CK-MB、cTnI、BNP、冠脉Gensini积分、LVEF值、LV、HCY等，并分析miRNA-21与这些临床指标的相关性。 结果：与对照组比较，冠心病患者miRNA-21表达差异均有统计学意义(P<0.05)；并且急性心肌梗死组较心绞痛组miRNA-21表达水平明显升高。AMI组和对照组CK、CK-MB、cTnI、Genisis积分比较差异有统计学意义(P<0.05)。相关分析表明：急性心肌梗死患者循环miRNA-21的表达量与CK、CK-MB、cTnI呈正相关性，与BNP、冠脉Gensini积分、LVEF值、LV存在负相关性。结论：冠心病患者miRNA-21表达较对照组表达水平升高，急性心肌梗死亚组更为显著。miRNA-21可能为急性心肌梗死潜在的诊断学标记物，其与冠脉狭窄程度有关，miRNA-21可能对缺血灌注损伤的心肌具有保护作用。

微小RNA；冠心病；qRT-PCR；冠脉狭窄；Genisis积分

冠心病是目前世界上发病率和致死率最高的疾病之一，严重危害人类健康。目前，虽然已有一些与冠心病相关的生物标志物，但仍然需要进一步寻找新的生物标志物来提供更早、更准确、更敏感的预警，为临床上对冠心病的早期诊断、治疗和预后判断提供依据。

微小RNAs(MicroRNAs，miRNA)是一类广泛存在于真核生物中进化保守的内源性非编码单链 RNA 小分子[1]，参与基因转录后的表达调控。多项研究表明miRNA参与冠心病发生、发展病理过程的调节。冠心病的发生机制如脂质代谢改变、血管壁细胞损伤和心肌细胞缺血缺氧等过程都与miRNA相关[2,3]。miRNA对心肌细胞缺血缺氧有保护作用[4]，其中miRNA-21还对损伤后新生内膜增生有促进作用，可在心肌梗死发生后减少心肌梗死的面积。故而，研究 miRNA-21在急性心肌梗死中表达水平对心梗患者的诊断、预后评估等方面具有重要的意义。Dong等[5]结扎SD大鼠左冠状动脉建立急性心肌梗死模型，在心肌梗死后6 h检测心肌细胞miRNA表达情况，发现miRNA-21在梗死区表达明显降低，而在临界区表达显著提高，并且可以通过缺血预处理阻止这种分布异常。

目前对 miRNA-21的相关研究主要集中在动物和细胞实验，临床研究少见报道。本研究纳入较大样本量，观察急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)患者、心绞痛(angina pectoris,AP)患者与冠状动脉无病变者血浆中 miRNA-21的表达是否存在差异，以明确 miRNA-21的临床意义，如与急性心梗生物标志物及心衰指标的相关性，为心肌梗死的防治提供新的思路和治疗靶点。

1 对象与方法

1.1 研究对象

连续收集2013年5月至2013年7月来自天津市胸科医院曾行冠脉CT或冠脉造影的患者，按照排除标准选择年龄40～75岁，共66例，男48 例，女18 例。

诊断标准：左主干、左前降支、左回旋支、右冠状动脉为主要血管，采用标准Judkins法，每支血管至少3个以上的多体位头投照，造影证实1支或1支以上血管直径狭窄>50%，诊断为冠心病。试验组：冠心病组。对照组：冠脉无病变组，此组患者以心前区不适入院，经冠脉CT或冠脉造影证实为冠状动脉无明显狭窄病变。其中对照组10例，冠心病组56例，冠心病组分为2个亚组：心绞痛组39例，急性心肌梗死组17例。

根据诊断指南将冠心病分为心肌梗死(AMI)组和心绞痛(AP)组。AMI入院标准：参照2010年“急性ST段抬高型心肌梗死诊断和治疗指南”[6]和2012年“非ST段抬高型急性冠状动脉综合征诊断和治疗指南”[7]，典型长时间的胸痛，伴有标准12导联心电图连续变化，或肌酸激酶(creatine kinase,CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)明显升高(大于正常上限的2倍以上)。AP组：患者近24 h内有静息心绞痛发生，伴心电图一过性明显的缺血性ST-T改变，但无明显的CK升高(小于2倍正常值上限)，在观察期间出现ST段抬高或新的Q波者不包括在内；典型的劳力性心绞痛，最近6个月内有恶化或静息心绞痛发作。

按照Gensini积分[8]方法对冠状动脉病变程度进行定量评价，根据美国心脏学会所规定的冠状动脉血管图像记录分段评价标准，对每支血管病变程度进行定量评定，每例患者冠状动脉病变程度的最终积分为3支主要分支的积分之和。

排除标准：合并有瓣膜性心脏病、急慢性感染性疾病、血液系统疾病、肿瘤、周围血管性疾病、严重肝肾功能不全、全身免疫性疾病、慢性阻塞性肺疾病、心律失常等疾病。

1.2 样品采集及处理

研究对象于空腹状态抽取外周静脉血2 ml，放入EDTA抗凝管，4℃，3 000 r/min离心10 min，吸取上清液于-80℃保存。所有样本采集和使用均经我院伦理委员会同意，并征得患者或患者家属知情同意。

采集研究对象的一般临床资料：包括性别、年龄、高血压史、糖尿病史、高脂血症史、吸烟史、血生化指标、造影结果等。冠脉造影采用标准Judkins法行左、右冠状动脉造影。

测定指标：测定研究对象血浆中miRNA表达水平，本研究冠心病组及对照组静脉血中miRNA相对表达水平比较采用2-△△CT法。miRNA的表达量=2-△CT，其中△CT为△CTmiRNA-21与△CT内参cel-39的差值，△△CT为△CT冠心病组与△CT对照组的差值。

1.3 主要试剂

总RNA提取试剂盒、RNA反转录试剂盒，荧光实时定量PCR(qRT-PCR)试剂盒， 荧光探针及外源性cel-miR-39；无水乙醇、无RNA酶纯水、7500荧光定量RCR仪；成熟miRNA 序列为UCACCGGGUGUAA AUCAGCUUG，ABI产品的ID为000200，微小RNA-21序列为UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA，ABI产品的ID为000397(ABI,美国)。

1.4 qRT-PCR

样品提取总miRNA，反转录后按照说明书进行荧光实时PCR(qRT-PCR)反应。qRT-PCR反应条件：95℃ 10 min； 95℃ 15 s，60℃ 60 s；40个循环，组内重复3次取平均值。microRNA表达水平以Ct值表示即每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。本研究冠心病组及对照组血浆中miRNA相对表达水平比较采用2-△△CT法。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组研究对象的基本情况

为排除其他因素对miRNA相对表达水平的影响，对AP组、AMI组和对照组的各种因素进行比较，结果发现各组之间各个影响因素的差异均无统计学意义(P>0.05，表1)。

Tab. 1 Comparison of the general data of patients with different clinical types

IndexControlgroup(n=10)APgroup(n=39)AMIgroup(n=17)Male(%)4(40.00)32(82.05)12(70.59)Smokinghistory(%)3(30.00)22(56.41)12(70.59)Drinkinghistory(%)3(30.00)6(35.90)8(47.06)Hypertension(%)4(40.00)25(64.10)11(68.75)Diabetes(%)1(10.00)11(28.21)4(23.53)Familymedicalhistory(%)3(30.00)16(41.03)6(35.29)Age(year)56.20±5.5059.70±8.4062.80±7.80BMI(kg/m)25.25±1.8025.25±2.3024.90±1.78TG(mmol/l)2.31±1.412.12±1.641.85±0.86TC(mmol/l)4.96±1.154.46±1.135.05±1.11HDL(mmol/l)1.18±0.311.11±0.201.16±0.26LDL(mmol/l)2.89±0.892.53±0.933.20±0.91ApoA1(g/l)1.20±0.161.13±0.251.17+0.28ApoB(g/l)1.02±0.280.93±0.261.12±0.29HCY(μmol/L)12.35±4.4815.87±7.3914.22±6.39GLU(mmol/L)5.89±1.056.38±1.937.49±2.08

BMI： Body mass index； TG： Triglyceride； TC： Total cholesterol； HDL： High density lipoprotein； LDL： Low density lipoprotein； ApoA1： Apolipoprotein A1； ApoB： Apolipoprotein B； HCY: Homocysteine； GLU: Fasting blood-glucose

2.2 miRNA-21在冠心病患者中的表达

与对照组相比，心绞痛组miRNA-21表达上调1.9倍(P<0.05)，而AMI组上调达3.2倍(P<0.05)，说明miRNA-21在AMI组表达异常活跃，可作为AMI诊断的参考指标(图1)。

2.3 miRNA-21在AMI患者ROC曲线

miRNA-21在冠心病患者表达差异有统计学意义，急性心肌梗死患者表达显著上调。在急性心肌梗死患者miRNA-21表达水平的敏感度为73.76%，特异度78.47%，研究表明 miRNA-21 可能是急性心肌梗死潜在的诊断学标记物。采用ROC曲线( receiver operating characteristic curve)评价循环miRNA-21相对表达量与急性心肌梗死的诊断是否有价值。循环 miRNA-21 表达量ROC曲线下面积AUC=0.6885(95%CI 0.6489～0.7282)，与CK、CK-MB、cTnI具有相似的敏感度(图2)，提示通过循环 miR-21判断急性心肌梗死与否具有较高准确性的诊断价值。

Fig. 2 Compared miRNA, CK, CK-MB, cTnI in diagnosis sensitivity of acute myocardial infarction(a-d)

2.4 AMI组、AP组和对照组CK、CK-MB、cTnI、Genisis积分的差异miRNA-21的相关性

CK、CK-MB、cTnI、BNP、冠脉Gensini积分分值、LVEF值、LV在急性心肌梗死组、心绞痛组、对照组间差异具有统计学意义(P<0.05)，与心肌缺血的发生和发展有关(表2)。采用Pearson 检验进行相关性分析，急性心肌梗死患者循环miRNA-21的表达量与CK、CK-MB、cTnI呈正相关性，与BNP、冠脉Gensini积分分值、LVEF值、LV存在负相关性，而在心绞痛组及对照组上述指标无明显相关性。

Tab. 2 Comparison of factors such as CK, CK-MB, cTnl, Genisis integral etc between AMI group,angina, angina group and the nonmal group

CK: Creatine kinase； CK-MB： Creatine kinase isoenzyme； cTnI: High sensitive troponin I； HCY: Homocysteine； BNP: B type natriuretic peptide urea； LVEF： Left ventricular ejection fraction； LV： Left ventricular end- diastole diameter

*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsAP group

3 讨论

心肌缺血是导致心肌细胞死亡的直接原因之一，许多研究也证明 miR-21 参与了心肌细胞凋亡及缺血/再灌注损伤。Yin C等[9]发现用热休克或预处理诱导miRNA-21表达可明显减少心肌梗塞面积，提示热休克蛋白70、内皮诱导性一氧化氮合成酶可能参与miRNAs介导的心肌保护机制。Van Rooij E等[10]对心梗病人的心肌组织标本也进行了miRNAs表达检测，发现心梗的边缘区mir-21明显上调，但在梗死区域内miR-21反而降低，与动物试验的心梗模型中的变化趋势一致。miRNA-21对缺血灌注损伤的心肌具有保护作用[11]。这一结果表明miR-21很可能在AMI早期起着相当重要的作用。

miRNA-21 在正常心脏中表达很低，但在各种心衰、心肌肥厚、缺血缺氧等条件下明显升高[12]，机制不同，如研究证明miR可能是通过负性调控L -型钙通道蛋白的表达,降低细胞内钙离子浓度,抑制心肌细胞肥大[13]。本研究证实了这一点，结果显示miRNA-21在急性心肌梗死组中表达量较对照组明显升高。这一研究结果与Duan X等人[14]的研究结果可相互印证，即miRNA-21的表达参与控制心肌缺血相关基因的调控，其调控策略复杂且包含多种的信号转导途径。本实验相关性分析可得出急性心肌梗死患者循环miRNA-21的表达量与心肌梗死诊断标志物CK、CK-MB、cTnI呈正相关性，与BNP、冠脉Gensini积分分值、LVEF值、LV存在负相关性。BNP升高、LV 增大、LVEF值降低，提示心功能减低，而实验所得急性心肌梗死患者血浆中miRNA-21的表达与其成负相关性。另外，本实验得出冠脉轻度狭窄患者和冠脉中重度狭窄患者的血浆中miRNA-21与对照组比较有统计学差异，说明miRNA-21与冠脉狭窄程度有关。这一结果证明了Kukreja RC等人的推测[4]，即miRNA-21可能参与心肌的缺血/再灌注(I / R)损伤和心脏衰竭的自身保护机制。

综合本研究的试验结果，急性心肌梗死患者中miRNA-21表达水平的敏感度为68.85%，与CK、CK-MB、cTnI诊断急性心肌梗死具有相似的敏感度，据此可推测 miRNA-21可能作为急性心肌梗死新的和敏感的预测诊断指标，不但为相关研究提供理论依据，也为临床诊治提供早期治疗的可能性，从而取得更好的预后疗效。这一展望与Wang F等人的期望相符[15]，即miRNAs可能是急性心肌梗死新的和强大的生物标志物，可能是AMI的潜在的诊断工具。

若要完美实现这一目标，需要解决miRNA-21的心肌特异性问题。已知miRNA-21为非心肌组织特异性存在的miRNA，其拥有多个靶基因，故其表达容易受到其他非研究因素的影响，如急性心肌梗死患者取血时心梗的时间会影响实验结果，实验组例数偏少及实验过程中实验样本在降解，可能存在误差偏移。大部分急性心肌梗死患者同时患有高血压病、糖尿病，这两种疾病对循环miRNA-21有所影响，继而干扰miRNA-21的检测结果。但Liu F等人的研究[16]认为，循环miRNA-21具有较好的心肌相关性，其表达和心肌功能和纤维化程度密切相关，可以作为心室细胞凋亡的敏感标志物。动物实验研究发现[17,18]， I/R(缺血/再灌注)组心肌胶原含量和左室舒缩功能明显降低， 血浆 CK、LDH 活力和心肌基质金属蛋白酶- 2 (MMP- 2) 蛋白表达及 miRNA 水平明显升高，基质金属蛋白酶抑制剂- 2(TIMP- 2) 蛋白明显降低，而IPTC(缺血后处理)组恰恰相反，其机制可能与抑制心肌中 MMP-2 表达， 促进 TIMP-2 表达有关。Roy等[19]利用miRNA-21模拟技术的小鼠实验有效地抑制PTEN-P13K-Akt-MMP2信号通路中miRNA-21靶基因PTEN的表达，促进Art磷酸化，上调MMP-2的表达，从而促进缺血/再灌注诱导的成纤维细胞引起心脏重构，明显减少了缺血/再灌注后心肌梗死面积。综上所述，本研究显示miRNA可能成为冠心病治疗的关键环节，以miRNA为药物治疗靶点对缺血心肌进行临床治疗提供新思路。

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Research on expression of miRNA-21 in the peripheral blood of coronary heart disease and its clinical significance

YANG Shou-juan1, ZHANG Ying2△, LIU Yin3

(1. The Graduate School, Tianjin Medical University, Tianjin 300070; 2. The Department of Cardiology, Tianjin Chest Hospital;3. CCU, Tianjin Chest Hospital, Tianjin 300222, China)

Objective: To study the expression difference in MicroRNA -21(miRNA-21)levels of the plasma between the patients with coronary heart disease and the subjects without coronary artery lesions, and its clinical significance. Methods: Plasma was obtained from the patients with coronary heart disease(trial group，56 cases)and the subjects without coronary artery lesions(control group，10 cases), patients with coronary disease were divided into angina(AP, 39 cases) and acute myocardial infarction(AMI, 17 cases)subgroup, the contents of miRNA-21 were detected using qRT-PCR method, and the differential expression of miRNA-21 in each group was analyzed. The levels of creatine kinase isoenzyme(CK-MB), high sensitive troponin I(cTnI), B type natriuretic peptide urea(BNP), Gensini, left ventricular ejection fraction(LVEF), integral value of coronary left ventricular end diastole diameter(LV) and homocysteine(HCY) were determined and the correlation between miRNA-21 and these clinical indexes was analyzed. Results: Compared with control group, there was a significant difference in expression of miRNA-21 in patients with angina and AMI(P<0.05),and miRNA-21 expression in AMI group was much higher than that in AP group. There was statistical significance in CK,CK-MB, cTnI,Genisis integral comparison between AMI group and control group (P<0.05).The correlation analysis showed that there was a positive correlation between expression of CK, CK-MB, cTnI and the level of circulating miRNA-21 in patients with acute myocardial infarction. And there was a negative correlation between BNP, Gensini integral, LVEF value of coronary artery, LV and circulating miRNA-21. Conclusion: miRNA-21 was significantly elevated in acute myocardial infarction subgroup than the control group. The level of miRNA-21 associates with the degree of coronary artery stenosis, and might be a potential marker for the diagnosis of acute myocardial infarction. miRNA-21 may play an important role in protecting myocardium from ischemia/reperfusion injury.

miRNA-21; coronary heart disease; real-time fluorescence quantitative PCR; coronary artery stenosis; Genisis integral/score

天津市卫生局科技基金项目(2012KZ056)

2014-11-13 【修回日期】2015-01-26

R541/R543

A

1000-6834(2015)02-127-005

10.13459/j.cnki.cjap.2015.02.009

△【通讯作者】Tel： 13299905349； E-mail： zy89769402@163.com