胶质细胞谷氨酸转运体-1a反义寡核苷酸的设计及效果评价*

刘丽哲， 张 敏， 刘宜先， 崔 鑫， 胡玉燕， 李文斌△

(1. 河北医科大学病理生理学教研室， 2. 河北医科大学生理学教研室， 石家庄 050017)



胶质细胞谷氨酸转运体-1a反义寡核苷酸的设计及效果评价*

刘丽哲1， 张 敏1， 刘宜先2， 崔 鑫1， 胡玉燕1， 李文斌1△

(1. 河北医科大学病理生理学教研室， 2. 河北医科大学生理学教研室， 石家庄 050017)

目的：应用IDT公司的Antisense design software设计胶质细胞谷氨酸转运体-1a(GLT-1a)的反义寡核苷酸(AS-ODNs)，并对其进行效果评价。方法：首先根据GLT-1a mRNA羧基末端特异序列，设计GLT-1a AS-ODNs；在此基础上，应用Western blot方法对设计的5条GLT-1a AS-ODNs抑制大鼠海马CA1区GLT-1a蛋白表达的效果进行评价。结果：序列为5’-GGTTCTTCCTCAACACTGCA-3’的GLT-1a AS-ODNs可特异性地抑制大鼠海马CA1区GLT-1a蛋白表达，而对GLT-1b的表达无影响。该AS-ODNs对sham和头孢曲松钠(Cef)诱导的大鼠GLT-1a的表达上调的抑制效果类似，均>60%；对脑缺血预处理(CIP)诱导的大鼠海马CA1区GLT-1a蛋白表达的上调亦具有明显的抑制作用，抑制效果>60%。结论：从设计的5条GLT-1a AS-ODNs中获得了可特异性抑制GLT-la表达的反义寡核苷酸序列。

GLT-1a；反义寡核苷酸；头孢曲松钠；脑缺血预处理；海马；大鼠

细胞外谷氨酸浓度的异常与许多神经系统疾病密切相关。胶质细胞谷氨酸转运体-1(glial glutamate transproter-1， GLT-1)在清除细胞外谷氨酸，使其维持低浓度方面发挥重要作用。因此对GLT-1的研究具有非常重要的理论和临床意义。根据羧基端不同，可将GLT-1分为GLT-1a， GLT-1b， GLT-1c三种剪接变异体，其中在海马GLT-1a占总GLT-1的90%左右[1]。随着研究的深入，GLT-1a在神经系统疾病中的作用日益受到重视，而研究GLT-1a在众多神经系统疾病中作用机制一个重要策略是阻断其表达和功能。但是目前尚未发现GLT-1a的特异性阻断剂。反义技术主要是利用Watson-Cricker 碱基配对原理，合成一段DNA或RNA片段，此片段与靶基因或mRNA具有互补序列，并能与特定的靶基因或mRNA形成杂交链，从而选择性地沉默靶基因。1978年，Stephenson 和Zamenick 报道[2]，与Rous病毒核酸序列互补的13 mer反义寡聚脱氧核苷酸能够抑制Rous病毒复制，首次提出了反义寡聚脱氧核糖核酸能够抑制特定基因表达的概念。从80年代末至今，人们利用反义核酸技术，进行了一系列的体外和体内抑制特定基因表达的实验。如有学者利用凋亡相关基因的反义寡核苷酸，研究该基因对癌组织的凋亡作用[3,4]；也有学者设计疾病相关因子的反义寡核苷酸，从而研究该因子在疾病中的作用等等[5,6]。因此，本实验针对GLT-1a mRNA羧基末端的特异序列进行GLT-1a AS-ODNs设计，利用Western blot技术对所设计的AS-ODNs进行筛选与效果评价，为研究GLT-1a在神经系统疾病中的作用提供可靠的技术方法。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

Alpha Imager凝胶图像分析系统(美国Alpha Inotech公司)，江湾Ⅰ型脑立体定位仪(淮北正华生物仪器设备有限公司)，EBA 12型高速低温离心机(德国Hettich公司)，DY89-Ⅱ型电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份公司)，酶标仪(奥地利TECAN)，水浴双垂直电泳槽(北京医疗设备厂)，DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂)，307-6台式牙钻车(上海医用分析仪器厂)。

GLT1a AS-ODNs、Sense ODNs及Missense ODNs序列(本实验室设计，上海生物工程技术服务有限公司生产)；兔来源GLT-1a多克隆抗体和小鼠来源GLT-1b单克隆抗体(Thermo公司)；小鼠来源β-actin多克隆抗体IgG1(Santa Curz Biotechnology公司)；生物素标记山羊抗兔和生物素标记山羊抗小鼠IgG(KPL公司)；辣根酶标记的链霉卵白素(Zymed laboratories公司)；头孢曲松钠(广州白云山制药总厂)；DAB(北京中杉生物工程公司)；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、磷酸二氢钾和氯化钙(北京化学试剂公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；脑室套管(深圳瑞沃德公司)；义齿基托树脂(Ⅱ型)(上海医疗器械股份有限公司)；502胶(广东爱必达胶粘剂有限公司)。

1.2 GLT-1a AS-ODNs的设计

根据大鼠GLT-1a mRNA羧基末端的特异序列(图1)，应用IDT公司的Antisense design software设计了5条GLT-1a AS-ODNs，5条GLT-1a AS-ODNs 依次简称为P1、P2、P3、P4、P5，其序列及对应的靶点序列见表1。

Fig. 1 C terminus specific sequences of GLT-1a mRNA

Tab. 1 Sequences of GLT-1a AS-ODNs(P1-P5) and their sequences of target point in rats

1.3 实验动物及分组

健康雄性Wistar大鼠75只，体重280～320 g，由河北医科大学实验动物中心提供。在实验室饲养1～2 d后，右侧脑室置管以建立侧脑室给药通道，恢复5 d后随机分为15组(n=5)。共包括以下3部分，各部分分组如下：

1.3.1 GLT-1a AS-ODNs对头孢曲松钠(ceftriaxone, Cef)诱导的GLT-1a蛋白表达上调的影响 (1)Cef+溶剂组：腹腔注射Cef(200 mg/kg)，每日1次，共5次；于第1次注射Cef后36 h、72 h以及108 h右侧脑室注射双蒸水(DW)(GLT-1a AS-ODNs的溶剂)10 μl；(2)Cef+GLT-1a AS-ODNs组：进一步分为P1～P5 5个亚组，分别给予相对应的GLT-1a AS-ODNs双蒸水溶液10 μl(18 nmol)，给予方法与(1)组双蒸水的给予方法相同。其它处理同(1)组。通过Western blot检测GLT-1a蛋白的表达数量。选择抑制效果>60%的序列，进一步观察其对GLT-1b蛋白表达的影响，以确定其抑制GLT-1a蛋白表达的特异性。

1.3.2 GLT-1a AS-ODNs对sham及Cef处理的大鼠海马CA1区GLT-1a蛋白表达抑制效果的比较

(1)Sham组：腹腔注射生理盐水(NS，0.8 ml/kg)，每日1次，共6次，于每次腹腔注射后即刻侧脑室注射DW 10 μl；(2)AS-ODNs组：以同样方法于每次腹腔注射NS后即刻侧脑室注射GLT-1a AS-ODNs的双蒸水溶液10 μl(15 nmol)；(3)Cef+溶剂组：腹腔注射Cef(200 mg/kg)，每日1次，共6次，于每次注射Cef后即刻侧脑室注射DW 10 μl；(4)Cef+GLT-1a AS-ONDs: 于每次腹腔注射Cef后即刻侧脑室注射GLT-1a AS-ODNs 的双蒸水溶液10 μl(15 nmol)，每日1次，共6次。以上各组均于末次腹腔注射后2 d取大鼠海马CA1区，应用Western免疫印迹分析法检测GLT-1a的表达。

1.3.3 GLT-1a AS-ODNs对脑缺血预处理 (cerebral ischemic preconditioning , CIP)诱导的大鼠海马CA1区GLT-1a蛋白表达的抑制作用 (1) Sham组：给大鼠进行全脑缺血的sham手术。(2) CIP组：给大鼠CIP处理3 min，之后恢复再灌流。 (3) AS-ODNs+CIP组：于CIP前2 d开始给大鼠侧脑室注射GLT-1a AS-ODNs溶液(15 μl，25 nmol)，后每间隔24 h注射1次，连续注射4次，其余处理同CIP组。同时，设GLT-1a的Sense ODNs (5’-TGCAGTGTTGAGGAAG AAC C-3’)和Missense ODNs (5’-GGTTCTTCGTCTACACTGCA-3’)对照组，分别侧脑室注射相对应的ODNs溶液。以上各组均于sham或CIP后2 d取海马CA1区，应用Western免疫印迹分析法检测大鼠海马CA1区GLT-1a的表达。

1.4 大鼠右侧脑室埋管

给大鼠腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg麻醉后，将其固定于脑立体定位仪(江湾I型C立体定位仪)上，首先切开头顶部皮肤，以充分暴露手术视野，然后分离骨膜，参照脑立体定位图谱，确定Bregmar点并标记，在此点右侧旁开1.5 mm，向后0.8 mm处颅骨钻孔，在此孔周围避开骨缝选择3个合适位置颅骨钻孔，深度适宜且不钻透，固定手表螺丝于3孔。将套管恢复至所钻第1个孔处，从骨面向下进3.8 mm，Ⅱ型义齿基托树脂固定注射套管以备侧脑室给药。动物回笼纳入单笼饲养，自由食水。

1.5 侧脑室注射

诱导大鼠钻入自制鼠袋中，露出鼻孔及套管外帽，待动物安静后，在大鼠清醒安静状态下将内芯旋出，将以PE50管连接微量注射器的消毒的内针插入，同时缓慢将药物推入(10 min)，留针10 min。注射结束后盖好套管帽，动物回单笼继续饲养。

1.6 CIP

全脑缺血3 min作为CIP。采用四血管闭塞法制造大鼠全脑缺血模型[7,8]。首先凝闭双侧椎动脉，具体操作如下：10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉后，枕骨后背侧颈部作纵切口约1.5 cm大小，后分离两侧颈旁肌以暴露第一颈椎横突，找到翼状孔后将预热的电灼针插入翼状孔中，将双侧椎动脉电热凝闭，使其永久闭塞。术后常规饲养，恢复2 d后行CIP。在乙醚吸入麻醉下，分离双侧颈总动脉，待动物清醒后夹闭双侧颈总动脉持续3 min后恢复双侧颈总动脉血流再灌。之后，庆大霉素冲洗、缝合伤口。在实验过程中，应用白炽灯照射以维持动物肛温在37℃，到恢复活动为止。全脑缺血前后观察大鼠翻正反射及瞳孔变化等以判断是否成功诱导全脑缺血。Sham组仅分离、暴露双侧椎动脉和双侧颈总动脉，但不阻断血流。

1.7 Western blot分析

各组大鼠在预定时间断头取脑，分离海马CA1区，分析天平称重后加入10倍体积的预冷裂解液，于冰浴下制成匀浆后静置30 min，4℃12 000×g离心15 min，取上清分装。提取蛋白后采用考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度。然后取蛋白样品50 μg ，经聚丙烯酰胺变性凝胶分离蛋白，电转膜法转移蛋白至PVDF膜上，5%的脱脂奶粉封闭后加入GLT-1a(兔抗大鼠，1∶1 000，lot no.: KH137955)、GLT-1b(小鼠抗大鼠，1∶1 000，lot no.: KL1273662)或β-Actin(小鼠抗大鼠，1∶1 500，lot no.:SC-4778)一抗，并于37℃孵育1 h，4℃静置过夜，洗涤液 ( TBS， 0.05 % Tween 20) 洗涤3次，加入二抗(羊抗兔或羊抗小鼠，1∶2 000，Lot no.:090207或Lot no.:080219) 37℃孵育 1 h ，洗涤液 ( TBS，0.05 % Tween 20) 洗涤3次，加入三抗(辣根酶标记的链霉卵白素，1∶1 000，Lot no.: 650578A)37℃孵育1 h，DAB显色。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 GLT-1a AS-ODNs对Cef诱导的大鼠海马CA1区GLT-1a蛋白表达的影响

Cef+溶剂组大鼠海马CA1区可见较强的GLT-1a表达(图2)和一定程度的GLT-1b的表达(图3)，与Cef+溶剂组相比，Cef+AS-ODNs(P2)组GLT-1a的表达明显降低，抑制效果>60%，而其它各组GLT-1a的表达均无明显变化(图2)；Cef+AS-ODNs(P2)组GLT-1b的蛋白表达无明显变化(图3)。以上结果表明，所设计的GLT-1a的5条AS-ODNs(P1～P5)中，P2能够有效抑制大鼠海马CA1区GLT-1a蛋白的表达，且其抑制效果具有特异性。因此，以下所有AS-ODNs均为该链。

2.2 GLT-1a AS-ODNs对sham及Cef诱导大鼠海马CA1区GLT-1a蛋白表达抑制效果比较

Sham组大鼠海马CA1区可见GLT-1a的基础表达。与sham组相比，AS-ODNs组GLT-1a蛋白表达明显下降，其表达量约占sham组的21%。Cef+溶剂组大鼠海马CA1区可见较高的GLT-1a的表达。与Cef+溶剂组相比，Cef+AS-ODNs组GLT-1a蛋白表达明显下降，其表达量约占Cef+AS-ODNs组的29%(图4)。以上结果表明，GLT-1a AS-ODNs即可抑制正常大鼠海马CA1区GLT-1a的基础表达，又可抑制Cef引起的大鼠海马CA1区GLT-1a蛋白表达的上调，且其抑制效果相似，均>60%。

2.3 GLT-1a AS-ODNs对CIP诱导的大鼠海马CA1区GLT-1a蛋白表达上调的抑制作用

Sham组可见大鼠海马CA1区有一定量的GLT-1a基础表达。与sham组相比，CIP后GLT-1a的表达明显上调。侧脑室注射GLT-1a AS-ODNs可抑制CIP引起的GLT-1a蛋白表达上调及GLT-1a的基础表达，表现为CIP+AS-ODNs组的GLT-1a蛋白表达与CIP组及sham组相比明显下调，而侧脑室注射GLT-1a Sense ODNs或Missense ODNs溶液则对CIP诱导的GLT-1a蛋白表达上调无明显影响，表现为Sense ODNs对照组和Missense ODNs对照组的GLT-1a蛋白表达与CIP组相比无明显变化 (图5)。 以上结果表明，GLT-1a AS-ODNs可以有效地抑制CIP引起的GLT-1a蛋白表达的上调。

3 讨论

近年来对GLT-1及其剪接变异体的研究越来越深入。Dumont[9]等对肌萎缩性侧索硬化症(ALS)的患者和疾病的动物模型中GLT-1的活性及其剪接变异体GLT-1a和GLT-1b的表达进行了研究，结果显示随着疾病的进展，GLT-1的总体活性降低，GLT-1a在颞叶皮层表达显著降低，而GLT-1b表达显著增高；在腰髓，GLT-1a和GLT-1b表达均明显升高。Amélie[10]等通过体外细胞培养的方法，研究TNF-α通过对肌萎缩侧所硬化大鼠皮层星形胶质细胞的GLT-1a和GLT-1b表达及活性调节影响谷氨酸转运。而Meabon[11]等学者对GLT-1的剪接变异体在胰腺的表达进行了研究，胰岛的β及α细胞都表达GLT-1a和GLT-1b，而外分泌导管区域主要表达GLT-1b。且发现在胰岛谷氨酰胺合成酶与GLT-1a和GLT-1b共表达，表明在胰腺GLT-1参与谷氨酰胺合成。以上众多研究提示GLT-1a和GLT-1b在同一处理因素下有着不同的调节，它们的作用值得进一步研究。

反义寡核苷酸是一段短序列的单链DNA，体外化学合成后，在体内按照碱基互补配对的原则，与其相对应的靶点序列互补，形成杂交链以干扰基因的复制、转录、剪切以及翻译，最终阻断某种蛋白的合成。近年来反义技术被广泛应用于各种研究，例如有学者应用P38 MAPK的反义寡核苷酸，研究其在肢体缺血预处理诱导的脑缺血耐受中的作用[12]，还有学者应用RyR的反义寡核苷酸研究Ryanodine受体对气道平滑肌细胞增值及细胞内Ca2+浓度的影响[13]。本实验设计GLT-1a的反义寡核苷酸旨在为研究其在脑缺血预处理诱导的脑保护中的作用提供方便，而大鼠海马CA1区是缺血最敏感的区域，因此整个实验选用此区。而应用反义寡核苷酸进行研究必须设置严格的对照以便明确其特异的抑制效应。本实验在脑缺血预处理(CIP)动物模型的基础上，设置CIP+AS-ODNs组的对照组CIP+Sense ODNs及CIP+ Missense ODNs，结果表明GLT-1a AS-ODNs能够显著抑制CIP诱导的GLT-1a蛋白的表达上调，而两个对照组对CIP诱导的GLT-1a蛋白的表达上调无影响。从而证实了所设计的AS-ODNs对目的基因的特异性抑制作用。

2005年Rothstein[14]等研究发现Cef可以上调大鼠海马组织GLT-1的表达，我室在2012[15]年就研究发现Cef对大鼠海马组织GLT-1a蛋白表达具有明显的上调作用，因此为了能够增强对比，提高筛选效率，本研究中我们以腹腔注射Cef的动物模型为筛选平台，使用Western blot免疫印迹方法，筛选能够有效抑制GLT-1a蛋白表达的反义寡核苷酸链。结果发现在这5条链中，只有P2链能够抑制目的基因的表达。说明通过计算机软件可以帮助我们寻找反义寡核苷酸作用的靶点，但必须通过实验来进一步证实其抑制作用。随后比较了GLT-1a AS-ODNs对sham及Cef诱导大鼠海马CA1区GLT-1a蛋白表达的抑制效果，结果发现GLT-1a AS-ODNs对这两种大鼠海马CA1区GLT-1a蛋白表达均有明显的抑制作用，且抑制效果相似都>60%，表明所用剂量的GLT-1a AS-ODNs没有因为Cef上调了GLT-1a蛋白表达而影响其抑制效果。说明其抑制效果稳定。最后本实验将其应用与脑缺血预处理大鼠，又明确了其对CIP诱导的GLT-1a表达上调的特异性抑制作用，进一步证实了其对目的基因强有力的抑制作用，并为研究GLT-1a在CIP诱导的脑保护作用中的功能提供实验依据。

[1] Holmseth S, Scott HA, Real K,etal. The concentrations and distributions of three C-terminal variants of the GLT-1 (EAAT2; slc1a2) glutamate transporter protein in rat brain tissue suggest differential regulation[J].Neurosci, 2009, 162(4): 1055-1071.

[2] Stephenson ML, Zamecnik PC. Inhibition of Rous sarcoma viral RNA translation by a specific oligodeoxyribonucleotide[J].ProcNatlAcadSciUSA, 1978, 75(1): 285-288.

[3] 马 玲, 田 敏. β1整合素反义寡核苷酸联合顺铂治疗人卵巢癌裸鼠移植瘤的研究[J]. 蚌阜医学院学报, 2014, 39(4): 433-437.

[4] 张 岚, 高冬玲, 温洪涛, 等. BCL-XL 反义寡核苷酸对食管癌 EC9706 细胞和裸鼠移植瘤组织的诱凋亡作用[J]. 郑州大学学报(医学版), 2014, 49(2): 146-149.

[5] 褚静英, 谢小芳, 颜 洁， 等. 联合应用 Survivin和VEGF反义寡核苷酸对肺癌 A549 细胞的抑制作用[J]. 中国现代医学杂志, 2014, 24(8): 46-50.

[6] 彭燕一, 蒋姣姣. PDGF-α受体反义寡核苷酸对增殖性玻璃体视网膜病变的影响[J]. 实用医学杂志, 2014, 30(4): 518-522.

[7] Kato H, Liu Y, Araki T,etal. Temporal profile of the effects of pretreatment with brief cerebral ischemia on the neuronal damage following secondary ischemic insult in the gerbil: cumulative damage and protective effects[J].BrainRes, 1991, 553(2): 238-242.

[8] Kitagawa K, Matsumoto M, Kuwabara K,etal. ‘Ischemic tolerance’ phenomenon detected in various brain regions[J].BrainRes, 1991, 561(2): 203-211.

[9] Dumont AO, Hermans E, Goursaud S. Differential regulation of the glutamate transporter variants GLT-1a and GLT-1b in the cortex and spinal cord of transgenic rats expressing hSOD1(G93A) [J].NeurochemInt, 2013, 63(2): 61-68.

[10]Dumont AO, Goursaud S, Desmet N,etal. Differential regulation of glutamate transporter subtypes by pro-inflammatory cytokine TNF-α in cortical astrocytes from a rat model of amyotrophic lateral sclerosis[J].PLoSOne, 2014, 9(5): e97649.

[11]Meabon JS, Lee A, Meeker KD,etal. Differential expression of the glutamate transporter GLT-1 in pancreas[J].JHistochemCytochem, 2012, 60(2): 139-151.

[12]孙晓彩, 李文斌, 李清君, 等. p38MAPK反义寡聚脱氧核苷酸阻断肢体缺血预处理诱导的脑缺血耐受[J]. 中国应用生理学杂志， 2010, 26(2): 129-132.

[13]王 英, 张睢扬, 钱桂生, 等. RyR反义寡核苷酸对气道平滑肌细胞增殖及细胞内钙离子浓度的影响[J]. 中国应用生理学杂志， 2005, 21(3): 324-328.

[14]Rothstein JD, Patel S, Regan MR,etal. Beta-lactam antibiotics offer neuroprotection by increasing glutamate transporter expression[J].Nature, 2005, 433(7021): 73-77.

[15]Liu YX, Zhang M, Liu LZ,etal. The role of glutamate transporter-1a in the induction of brain ischemic tolerance in rats[J].Glia, 2012, 60(1): 112-124.

Designation and evaluation of antisense oligodeoxynucleotides targeted to glial glutamate transporter-1a

LIU Li-zhe1, ZHANG Min1, LIU Yi-xian2, CUI Xin1, HU Yu-yan1, LI Wen-bin1△

(1. Department of Pathophysiology, Hebei Medical University, 2. Department of Physiology, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China)

Objective: The present study was undertaken to design antisense oligodeoxynucleotides (AS-ODNs) of glial glutamate transporter-1a (GLT-1a) and to evaluate the effectiveness of the designed AS-ODNs on the expression of GLT-1a. Methods: Five sequences of GLT-1a AS-ODNs were designed according to the C terminus specific sequences of GLT-1a mRNA using antisense design software of IDT Company. Western blot analysis was used to evaluate the inhibition effects of the five GLT-1a AS-ODNs on the expression of GLT-1a. Results: The sequence of GLT-1a AS-ODNs with sequence of 5’-GGTTCTTCCTCAACACTGCA-3’ could specifically inhibit the expression of GLT-1a in the hippocampal CA1 subfield of rats, while it had no effect on the expression of GLT-1b. This sequence showed similar inhibition on the expression of GLT-1a in sham and ceftriaxone (Cef) -treated rats. It could also significantly inhibit the cerebral ischemic preconditioning (CIP) -induced up-regulation in the expression of GLT-1a. The magnitude of the inhibition in sham, Cef- or CIP- treated rats was similar by more than 60%. Conclusion: From the designed five sequences of GLT-1a AS-ODNs, we obtained an effective sequence which can specifically inhibit the expression of GLT-1a.

GLT-1a; AS-ODNs; ceftriaxone; cerebral ischemic preconditioning; hippocampus; rat

国家自然科学基金资助项目(81271454)

2014-10-13

2015-02-12

R363

A

1000-6834(2015)03-238-06

10.13459/j.cnki.cjap.2015.03.012

△【通讯作者】Tel： 0311-86265607； E-mail： liwbsjz@163.com