刹毒草合剂对免疫抑制小鼠免疫功能的影响*

卢舜飞, 汪亮亮, 卢俊婉, 刘丙进, 童应鹏, 程晓东, 叶挺梅△

(1. 丽水学院医学院， 浙江丽水 323000; 2. 浙江工业大学药学院, 杭州 310014； 3. 同济大学生命科学与技术学院， 上海 200092)



刹毒草合剂对免疫抑制小鼠免疫功能的影响*

卢舜飞1, 汪亮亮1, 卢俊婉1, 刘丙进1, 童应鹏2, 程晓东3, 叶挺梅1△

(1. 丽水学院医学院， 浙江丽水 323000; 2. 浙江工业大学药学院, 杭州 310014； 3. 同济大学生命科学与技术学院， 上海 200092)

目的：研究刹毒草合剂对免疫抑制小鼠免疫功能的影响。方法：BALB/C小鼠50只随机分为5组(n=10): 空白组、模型组、刹毒草合剂低、中、高剂量组。除空白对照组外，其余各组小鼠腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg建立免疫抑制模型。空白组和模型组灌胃生理盐水，刹毒草合剂低、中、高剂量组每天分别用刹毒草合剂 10、20、40 ml/kg灌胃，连续给药15 d后，检测小鼠外周血白细胞数和白介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、干扰素-γ(IFN-γ)含量；检测小鼠脾脏指数、NK细胞活性。 结果：与模型组比较，刹毒草合剂能显著增加外周血白细胞数和IL-2、TNF-α、IFN-γ含量、提高脾脏指数和NK细胞活性，差异均有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。结论：刹毒草合剂可明显增强环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的免疫功能。

刹毒草合剂；免疫抑制；免疫功能

肿瘤化疗后及HIV感染患者的机体免疫力明显抑制，近年来研究发现中药复方制剂对人体的整体免疫起一定的调节作用[1,2]，临床上常用于免疫低下患者的治疗。复方制剂中各药物间相辅相成，有协同作用，药效优于单味中药。刹毒草合剂是本课题组经多年临床研究筛选出的中药复方，主要由黄芪、黄芩、灵芝、甘草等组成，具有益气助阳，清热解毒，活血化瘀等功效。传统医学的扶正疗法和现代医学的人体免疫功能密切相关，但其内在机制尚不明确，本研究通过观察刹毒草合剂对环磷酰胺所致免疫抑制小鼠免疫功能的影响，探讨其免疫调节机制，为进一步临床应用与开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康BALB/C小鼠，SPF级，雌雄各半，体重17～22 g，6～8周龄，由扬州大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证：SCXK(苏)2012-0004，实验动物使用许可证：SCXK(浙)2008-0117。

1.2 实验药物、主要试剂和仪器

刹毒草合剂，批号：100601，浙江省安福生物科技开发有限公司提供；环磷酰胺注射液，批号：090410，浙江省海正药业股份有限公司。YAC-1细胞由中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所提供；RPMI 1640 细胞培养液、胎牛血清和Hank's液均购自美国Gibico公司；流式细胞仪溶血剂购自北京旷博生物技术有限公司；IL-2、TNF-α、IFN-γ ELISA试剂盒均购自美国eBioscience公司。AG285电子天平(瑞士Mettler公司)；MAX190酶标仪(美国分子仪器公司)；Suprafuge 22 型离心机(德国 Heraeus)；XDS-1B倒置显微镜(重庆光电仪器公司)；二氧化碳培养箱(美国Thermo Fisher)。

1.3 动物分组及给药方法

SPF级BALB/C小鼠50只，雌雄各半，随机分为5组(n=10): 空白对照组(Control)、模型组(Model)、刹毒草合剂(SDCM)低、中、高剂量组。除空白对照组小鼠腹腔注射生理盐水外，其余各组腹腔注射环磷酰胺40 mg/kg造模，隔日1次，共3次。于造模结束后次日开始灌胃给药，给药剂量按小鼠临床等效量计算，低、中、高剂量组每日分别给予刹毒草合剂10 ml/kg、20 ml/kg、40 ml/kg，空白对照组和模型组给予同体积生理盐水，灌胃体积：0.4 ml/10 g，连续给药15 d。

1.4 外周血白细胞(WBC)数测定

于末次给药24 h后，摘除小鼠眼球采集全血，取20 μl至装有380 μl 2%冰醋酸的1.5 ml离心管中，倒置显微镜计白细胞总数。

1.5 血清IL-2、TNF-α、IFN-γ测定

于末次给药24 h后，摘取小鼠眼球采集全血，分离血清，血清IL-2、TNF-α、IFN-γ浓度的测定严格按ELISA试剂盒说明书步骤进行。

1.6 脾脏指数测定

于末次给药24 h后颈椎脱臼法处死小鼠，称小鼠体重，无菌取脾并称湿重，以小鼠脾重/体重(mg/g)计算脾脏指数。

1.7 NK细胞活性测定(LDH测定法)

于末次给药24 h后处死小鼠，无菌取脾制备脾细胞悬液，调整细胞浓度为2×107cells/ml 作为效应细胞。传代培养YAC-1细胞(细胞浓度为4×105cells/ml)作为靶细胞。取靶细胞和效应细胞各0.1 ml(效靶比50∶1)，加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各0.1 ml，靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40各0.1 ml ；每份标本均设三个复孔，置于37℃、5%CO2培养箱中培养4 h，取出后将96孔培养板以1 500 r/min离心5 min，每孔吸取上清0.1 ml置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液0.1 ml，根据室温不同反应3～10 min，每孔加入1 mol/L的HCl 30 μl以终止酶促反应。在酶标仪490 nm处测定光密度值(OD)。NK细胞活性%=[(反应孔OD值-自然释放孔OD值)/(最大释放孔OD值-自然释放孔OD值)]× 100%。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 刹毒草合剂对免疫抑制小鼠外周血WBC数、脾脏指数及NK细胞活性的影响

模型组小鼠外周血WBC数较空白对照组显著降低(P<0.01)，脾脏指数和NK细胞活性明显低于空白对照组(P<0.05)。与模型组比较，刹毒草合剂中、高剂量组能显著提高免疫抑制小鼠外周血WBC 数(P<0.01)；各剂量组均能显著提高免疫抑制小鼠脾脏指数(P<0.01)；低剂量组可明显提高免疫抑制小鼠NK细胞活性(P<0.05)，中、高剂量组可显著提高免疫抑制小鼠NK细胞活性(P<0.01，表1)。

GroupDose(ml/kg)WBC(105cells/ml)Spleenindex(mg/g)FunctionofNKcells(%)Control/61．8±15．86．47±0．5960．4±16．2Model/6．2±2．0∗∗5．75±0．56∗40．7±18．9∗SDCM107．6±2．88．43±1．68##67．3±20．9#SDCM2010．0±2．8##10．35±1．90##72．5±22．0##SDCM4012．0±3．9##11．63±2．85##80．3±18．7##

SDCM: Shadu Cao Mixture

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group

2.2 刹毒草合剂对免疫抑制小鼠血清IL-2、TNF-α、IFN-γ的影响

模型组小鼠血清IL-2、TNF-α及IFN-γ明显低于空白组(P<0.05，P<0.01)；与模型组比较，刹毒草合剂低、中、高剂量组显著提高免疫抑制小鼠血清IL-2(P<0.01)；低剂量组小鼠血清TNF-α及IFN-γ较模型组有所提高但无统计学意义，中、高剂量组血清TNF-α及IFN-γ显著高于模型组(P<0.01，表2)。

GroupDose(ml/kg)IL⁃2(pg/ml)TNF⁃α(pg/ml)IFN⁃γ(pg/ml)Control/112．65±3．8823．06±3．4846．23±5．31Model/104．01±7．51∗∗19．59±1．44∗40．69±3．48∗SDCM10117．61±6．17##20．31±1．6043．31±4．35SDCM20117．16±4．77##22．57±2．46##49．72±5．24##SDCM40127．01±13．60##36．74±7．23##58．37±6．19##

SDCM: Shadu Cao Mixture

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group

3 讨论

HIV感染、肿瘤等疾病的发生及发展与机体免疫功能密切相关[3]。中医认为人体免疫功能即正气，是机体抗御外邪及防治疾病的基本物质。现代药理学研究表明中药对调节机体免疫力有重要的作用[4-6]，通过增强机体的免疫功能而发挥抗病毒、抗肿瘤作用。刹毒草合剂是在传统医学“扶正祛邪、调整阴阳”理论的指导下筛选出的用于辅助治疗艾滋病、肿瘤化疗后等免疫功能低下患者的中药复方制剂，具有益气助阳、清热解毒、活血化瘀等功效，可调节机体阳气虚弱、热毒瘀阻、神疲乏力、少气懒言等症，通过扶正治疗起到免疫增强作用。环磷酰胺致免疫抑制小鼠是研究药物免疫调节作用较为理想的动物模型[7]。本研究探讨刹毒草合剂对环磷酰胺致免疫抑制模型小鼠免疫功能的影响。

外周血WBC是机体重要的免疫细胞，脾脏是淋巴细胞居留、增殖和产生免疫效应的物质基础，在机体免疫防御中有重要作用。脾脏指数高低能反应机体的非特异性免疫力，是衡量机体免疫功能的初步观察指标[8]。本研究发现环磷酰胺造模后小鼠的WBC数、脾脏指数显著低于空白组，在给予不同剂量刹毒草合剂治疗后显著提高免疫抑制小鼠WBC数、脾脏指数，呈一定的剂量相关性。说明刹毒草合剂对免疫低下小鼠白细胞功能、脾脏功能有一定的保护和恢复作用，通过增强非特异性免疫提高环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠的免疫功能。

NK 细胞是具有免疫调节作用的机体天然免疫细胞，是构成机体第一道免疫防线的自然杀伤细胞[9]。活化的NK细胞可合成和分泌细胞因子，具有抗肿瘤、抗感染和发挥免疫调节作用[10,11]。本研究结果表明，刹毒草合剂各剂量组可明显提高免疫抑制小鼠NK细胞活性，呈现出一定的剂量依赖性。提示刹毒草合剂可通过增强细胞免疫提高环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠的免疫功能。

细胞因子通过多种途径参与免疫调节作用。IL-2的产生作为细胞免疫效应的主要指标[12]，IL-2主要由CD4+CD8+T细胞分泌产生，能激活多种免疫细胞，促进抗体和细胞因子产生[13,14]，可增强T细胞杀伤活性并诱导其分泌TNF、IFN-γ、CSF等细胞因子。IL-2促进B 细胞的免疫应答以及NK 细胞、单核巨噬细胞的增生而增强抗肿瘤、抗病毒作用[15,16]。本研究结果显示，刹毒草合剂各剂量组可显著提高免疫抑制小鼠血清IL-2浓度，这与本研究结果NK细胞的活性增强密切相关； TNF-α是主要由单核-巨噬细胞分泌的、具有多种生物学活性的另一种重要细胞因子。TNF-α可通过TNFR诱导肿瘤细胞的凋亡，在抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用。另外，TNF-α可激活 T 细胞，促进 B 细胞产生抗体、单核细胞等产生细胞因子、白细胞杀伤病原微生物等功能[17]。IFN-γ是在免疫应答中发挥重要作用的细胞因子。主要由活化的Th1细胞和NK细胞所产生，并通过增强Th1细胞活性而提高细胞免疫功能，可诱导MHC-I/II各种分子的表达，促进中性粒细胞、单核巨噬细胞的吞噬功能，增强NK细胞作用，刺激合成血管内皮细胞粘附分子等。本研究结果显示刹毒草合剂中、高剂量组可显著提高免疫抑制小鼠血清TNF-α及IFN-γ浓度，并呈剂量依赖性。提示刹毒草合剂可通过提高环磷酰胺诱导免疫抑制小鼠血清IL-2、TNF-α及IFN-γ的浓度而发挥免疫调节作用。

综上所述，刹毒草合剂可恢复或增强环磷酰胺致免疫抑制小鼠的免疫功能，该研究为其在抗肿瘤、HIV感染的临床应用提供了实验依据，其深入的分子机制还有待进一步研究。

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The effects of Shadu Cao Mixture on immune functions of immunosuppression mice

LU Shun-fei1, WANG Liang-liang1, LU Jun-wan1, LIU Bing-jin1, TONG Ying-peng2， CHENG Xiao-dong3， YE Ting-mei1△

(1. College of Medicine, Lishui University, Lishui 323000; 2.College of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310014; 3.School of Life Sciences and Technology, Tongji University， Shanghai 200092, China)

Objective: To investigate the effects of Shadu Cao Mixture(SDCM, traditional Chinese medicine) on immune functions of immunosuppression mice. Methods: Fifty BALB/C mice were randomly divided into blank control group, model group, SDCM low-dose, middle-dose and high-dose group. Except the blank control group, other groups were intraperitoneal injected with cyclophosphamide (40 mg/kg) to establish immunosuppression mice model. The blank control group and model group

gavage administration with normal saline, while the other groups received gavage administration with different doses of SDCM (10, 20, 40 ml/kg for 15 days) respectively. The number of leukocytes and serum levels of interleukin-2(IL-2), tumor necrosis factor-α(TNF-α) and interferon-γ(IFN-γ) in peripheral blood, spleen index, and the function of NK cells were measured. Results: Compared with the model group , SDCM increased the number of leukocytes and serum concentrations of IL-2,TNF-α and IFN-γ in peripheral blood and improved the spleen index and the function of NK cells significantly (P<0.05～0.01). Conclusion: SDCM could remarkably enhance the immune functions of immunosuppression mice induced by cyclophosphamide.

Shadu Cao Mixture(traditional Chinese medicine); immunosuppression; immune function

浙江省自然科学基金项目(LQ12H29001);浙江省自然科学基金项目(LQ14H290001);浙江省科技厅重大科技专项社会发展项目(2011C03002)

2014-10-20

2015-02-12

R285.5

A

1000-6834(2015)03-266-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.03.019

△【通讯作者】Tel: 0578-2680382, E-mail: lsxylu@163.com