沉积物中重金属Pb和Cd对河蚬的毒性效应研究

韩雨薇，张彦峰，陈萌，钟文珏，祝凌燕

南开大学环境污染过程与基准教育部重点实验室 天津市生态环境修复与防治重点实验室 南开大学环境科学与工程学院，天津 300071

沉积物中重金属Pb和Cd对河蚬的毒性效应研究

韩雨薇，张彦峰*，陈萌，钟文珏，祝凌燕

南开大学环境污染过程与基准教育部重点实验室 天津市生态环境修复与防治重点实验室 南开大学环境科学与工程学院，天津 300071

以河蚬为受试生物，以存活率、呼吸抑制率为测试终点，研究了沉积物和上覆水中重金属Pb、Cd对底栖生物的毒性效应，并探讨了沉积物中酸挥发性硫化物(acid volatile sulfide，AVS)和同时提取金属(simultaneously extracted metals，SEM)对重金属生物有效性的影响。结果表明，沉积物中Pb、Cd对河蚬致死效应较低，当Pb、Cd浓度分别为400、100 mgkg-1，连续暴露21 d时，致死率低于20%；沉积物中Pb、Cd对河蚬14 d的呼吸抑制率 EC50分别为519和151 mgkg-1；上覆水中Pb和Cd离子浓度较低，对生物毒性效应贡献可以忽略；SEM/AVS值和生物呼吸抑制率有着明显的线性相关性，当SEMPb/AVS>1，SEMCd/AVS>0.6时，重金属对河蚬有明显的毒性效应。

重金属；Cd；Pb；河蚬；沉积物；呼吸抑制率；酸挥发性硫化物

重金属Pb和Cd都具有较强的生物毒性，它们可以通过多种途径进入水体，并通过吸附在颗粒物上最终进入沉积物。因此，沉积物成为重金属的一个重要的汇，对营底栖生活的生物构成威胁[1]。研究沉积物污染效应是水环境研究中不可缺少的一部分，重金属作为沉积物中的一类主要污染物，具有毒性大、难降解、易被生物富集等特性。由于具有生物富集性，一些重金属甚至在鱼、贝类等水生生物中积累到较高的浓度，最终经过食物链传递影响生态系统和人体健康[2-4]。曾毅等[5]对太湖沉积物毒性识别评估研究发现重金属中主要是Pb对底栖生物产生毒性效应，有研究表明高州水库表层沉积物重金属的污染程度强弱顺序为Zn > Cd > Cr > Ni >Pb≈Cu>Mn≈As，处于无污染至中度污染程度[6]。目前关于水相中重金属对水生生物毒性效应和沉积物中重金属分布及生态风险评价的研究较多，而有关沉积物中重金属毒性与生物有效性的研究则较少。范文宏等[7]以大型蚤为受试生物研究了水体-沉积物共存体系中Cd的毒性，而赵艳民等[8]以泥鳅死亡率、血液红细胞数量等指标考察了沉积物中Cd的毒性效应。

河蚬(Corbicula fluminea)隶属于软体动物门、瓣鲍纲，真瓣鲍目，蚬科。原产中国，广泛分布于我国内陆水域、朝鲜、日本、东南亚各国。栖息于底质多为沙或泥的江河、湖泊等水域，具有个体较大、适应性强、容易采集等特点，是一种滤食性动物，以水中的浮游生物(如硅藻、绿藻、原生动物、轮虫等)为食料。对有毒污染物有较高的富集能力，能直接反映水体中多种污染物的污染程度，因而被认为是一种能反应水体重金属污染的生物指示物[9-10]。河蚬对水体中的重金属、有机污染物等均有明显的吸收和富集作用，以往研究多侧重于野外生态现状调查，近年来有一些关于水体中污染物对河蚬的蓄积和毒性的研究报道[11-14]，但是对于全沉积物中重金属对河蚬的毒性研究还较少。

因此本研究采用河蚬为受试生物，探讨沉积物中Pb和Cd对河蚬的毒性效应，同时讨论沉积物中酸可挥发性硫化物(acid volatile sulfide,AVS)和同时提取重金属(simultaneously extracted metals,SEM)与生物毒性的关系。本研究为制定符合实际的沉积物重金属质量基准提供基础数据，为治理淡水沉积物的重金属污染提供科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 加标沉积物样品的制备

由于很难获得重金属本底值较低的天然沉积物，因此本研究采用Pasteris等[15]推荐的方法，用洁净的农田土壤加标染毒来模拟天然沉积物进行试验。从天津市郊区农田采集洁净土壤，经自然风干后，过40目筛去除粗颗粒，室温下保存备用。所用土壤中有机质含量为1.9%，pH为7.86，机械组成为粉砂64%、粘土24%、沙子12%。重金属浓度值(测定结果见表1)与国家标准进行比较，Cr、Ni、Cu、Zn、Hg、Pb的背景值达到我国土壤环境质量标准(GB 15618环境质量标准)的一级标准，而Cd和As的浓度值高于一级标准，低于二级标准，基本不会对生物造成毒害作用。

使用分析纯的CdCl2、Pb(NO3)2试剂(购自天津光复精细化工研究所)，用去离子水配制金属离子浓度为1 000 mg·L-1的储备液备用。取100 g沉积物样品，置于1 L玻璃烧杯中，加入一定体积的重金属储备液，配制成含有不同浓度梯度的染毒沉积物，根据文献[16]中Pb、Cd的SQG (sediment quality guideline，沉积物质量基准)值，Pb的TEL(threshold effect level，临界效应浓度)与PEL(probable effect level，必然效应浓度)分别为47.3和204 mgkg-1，Cd为3.02和19.0 mgkg-1，据此设计各试验组沉积物中Pb和Cd的加标浓度，具体染毒浓度见表2。然后加入去离子水至600 mL，此时，沉积物与上覆水的体积比为1:3。对泥水混合物充分搅拌1 h，之后置于室温下储存14 d。期间，每隔3 d充分搅拌1次，对照组沉积物除不加重金属外按相同方法处理。加标组和对照组均设置3个平行。染毒平衡14 d后，取沉积物样和上覆水样测定实际暴露浓度，结果见表2。沉积物中加标浓度与实测浓度之间的相对偏差大多在±10%以内；受沉积物本底影响，低浓度染毒时的偏差要高于高浓度染毒组。

表1 天津市郊区土壤中重金属背景值Table 1 Background values of heavy metals in Tianjin suburbs soil

表2 Pb和Cd加标浓度、实测浓度、相对偏差及在上覆水中的浓度Table 2 Spiked and measured concentrations of Pb /Cd in sediment,and the concentrations of Pb/Cd in the overlying water

1.2 生物测试

1.2.1 受试生物

试验所用河蚬取自中国科学院生态环境研究中心，暴露试验前在实验室置于10 L的聚乙烯塑料箱中驯养，加入经曝气48 h除氯水，每箱中放入150只，河蚬壳长(1.2±0.2) cm，壳高(0.8±0.2) cm，pH为6.8～7.5，溶解氧不低于4 mgL-1，温度(232) ℃，每2 天喂食1次螺旋藻粉。在该条件下驯养10 d，死亡率<10%，挑选健康河蚬进行试验，实验前1 天清肠24 h。

1.2.2 沉积物和上覆水溶液中河蚬毒性试验

参考US EPA(美国国家环境保护局)底栖生物标准试验方法[17-18]，进行21 d河蚬毒性试验。随机选取8只放入染毒沉积物中，连续暴露21 d。实验过程中不喂食，每天观察河蚬的活动情况和中毒症状，死亡个体及时去除。每隔7天补充1次上覆水，保证泥和水的体积比一致。

为了研究上覆水中重金属对河蚬毒性的贡献，取上覆水测定其中重金属离子的浓度，配置相同浓度的金属离子水溶液，同样在1 L烧杯中进行生物试验，每个烧杯中放8只河蚬，每天同一时间换水，去除死亡个体，每2天喂食1次螺旋藻粉。其他条件与沉积物中暴露试验一致。

河蚬呼吸速率实验参考曾丽璇等[19]的方法，选用500 mL三角瓶作为代谢瓶，预先用量筒记录每个代谢瓶中水的体积。同时设置空白组和实验组，在每个代谢瓶内放河蚬3个(实验前测定河蚬的湿重)装水后用PE保鲜膜封口。河蚬开壳后开始计时，持续2 h，用溶氧仪测定2 h内代谢瓶中溶解氧的变化。根据实验前后代谢瓶内水中溶解氧的变化值，按下列公式计算河蚬的耗氧率和呼吸抑制率。

OR=[(DO0-DOt)×V ]/ (W×t)

式中：OR为单位体重耗氧率，mg·(g·h)-1；DO0和DOt为实验开始和在t时间时水中溶解氧的含量，mg·L-1；V为代谢瓶中水的体积，L；W为河蚬质量，g；t为实验持续时间，h。

1.3 沉积物和上覆水中重金属及AVS、SEM含量测定

取适量沉积物样冷冻干燥后，准确称取0.1 g放入微波消解罐中。用6 mL浓HNO3、2 mL HF和2 mL H2O2(均为优级纯，购自天津市化学试剂五厂)作为消解液，采用微波萃取快速消解系统(MD 6C-6H，北京盈安美诚科学仪器有限公司)进行消解，取上清液过0.45 μm滤膜定容，使用ICP-MS(电感耦合等离子体-质谱法，ELAN DRC-e，Perkin Elmer SCIEX)测定重金属浓度，上覆水样过膜后直接测定。该方法回收率为90%103%之间，检出限为0.01 μg·L-1，相对标准偏差<5%。

采用US EPA推荐的吹气-吸收-比色方法测定沉积物中的AVS[20-21]。AVS与盐酸反应生成硫化氢气体，使用氮气吹出后被吸收液吸收，通过亚甲基蓝比色法测定硫化物浓度。将提取完AVS剩下的泥水混合物离心，取上清液过0.45 μm滤膜后用ICP-MS测定其中重金属含量，即为SEM。

1.4 数据处理

试验中数据采用Excel 2007进行处理，用SPSS16.0统计软件t-检验法对组间数据进行差异性分析(95%置信区间)，运用Origin 8.5作图，根据直线内插法计算 EC50。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 沉积物中Pb/Cd对河蚬的毒性效应

2.1.1 沉积物中Pb/Cd对河蚬21 d的慢性毒性效应

河蚬活动于沉积物表层或潜入沉积物，滤取水中悬浮的有机颗粒为食物，能直接反应沉积物的污染状况。当污染物浓度较高时，河蚬通过闭合外壳、减少摄食而降低污染物的摄入量，由于河蚬的这种自我保护行为，在染毒的沉积物中河蚬的死亡率较低。在沉积物染毒暴露21 d后记录了河蚬的死亡率和下潜率，结果见图1。21 d实验结束后空白对照中河蚬存活率均为96%，在低浓度组(I)时河蚬存活率和对照组相比差别不大，随着Pb、Cd染毒浓度的增加存活率轻微降低，即使在最高浓度组，河蚬的死亡率也只有20%左右，和其他研究中Pb/Cd对底栖生物泥鳅[21]、水丝蚓[21]、伸展摇蚊[21]的毒性效应相比(表3)，河蚬的耐毒性更强，因此用存活率难以描述重金属对河蚬的毒性。但是，受重金属影响，河蚬的一些生理行为受到抑制，如下潜、呼吸等频率降低，因此可以用河蚬的挖掘行为、呼吸率等作为双壳类生物敏感的指示终点[22-23]。实验结束后，空白组有83%河蚬潜入沉积物中，随着染毒浓度增加，下潜比率逐渐降低，当Pb、Cd浓度分别为224，37.6 mg·kg-1时只有大约50%～60%的河蚬潜入沉积物中。经观察，在受污染的沉积物中，河蚬主要停留在沉积物表面，双壳紧闭，滤食行为和速率均降低，以此减少对污染物的暴露[24]。暴露在高浓度组中的河蚬，

呼吸速率下降，为了获得更多的溶氧而停留在沉积物表面。低浓度组中的河蚬入水和出水管伸出壳外，长时间不会收缩；而暴露在高浓度组中的河蚬只在短时间内伸出入水和出水管，产生了明显的规避行为。

2.1.2 沉积物中Pb/Cd对河蚬14 d的亚慢性毒性效应

水生生物在呼吸和排泄过程重要的指标，如耗氧率和排氨率的变化可以作为反映重金属毒性的敏感指标[25]。因此在暴露14 d时测定了河蚬的呼吸速率。和空白组相比，低浓度组(I)对河蚬的呼吸速率几乎没有影响，随着染毒重金属浓度的增大，在Pb为70.8 mg·kg-1，Cd为5.3 mg·kg-1时对河蚬呼吸速率有轻微的影响，在高浓度组(IV，V)河蚬呼吸速率明显下降，说明该浓度下Pb、Cd已经对河蚬产生了抑制作用。比较Pb、Cd 两种重金属，Cd对河蚬的呼吸抑制作用明显高于Pb，其生物毒性更大。当沉积物中Pb、Cd浓度分别为126、14.1 mg·kg-1时已经对河蚬的正常机体代谢活动产生显著的抑制毒性。

表3 沉积物中Pb、Cd对典型底栖生物的 LC50Table 3 The LC50 of Pb/Cd in sediment on typical benthic organisms

图1 沉积物中河蚬暴露于Pb/Cd 21 d时的存活率和下潜率

图2 Pb、Cd加标试验组河蚬染毒浓度和呼吸抑制率关系

图2为河蚬呼吸抑制率和沉积物Pb、Cd加标浓度的线性回归分析，可以看出两者线性拟合度很好(R2值分别为0.919、0.977，P值均小于0.01)。由此得出Pb、Cd对河蚬呼吸抑制率的半数效应浓度(EC50)分别为519和151 mg·kg-1。

2.2 上覆水中Pb、Cd对河蚬的影响

由于河蚬活动于沉积物表层或钻入沉积物，其出水管和入水管暴露在上覆水中，因此上覆水中的污染物也可能对其产生一定的影响。为了研究沉积物上覆水中金属离子对河蚬的毒性作用，本试验进行了与上覆水中Pb和Cd含量相同的水相21 d的毒性试验。上覆水中Pb和Cd的离子浓度分别在10.0～110、0～40.0 μg·L-1之间,它们对河蚬的毒性效应如图3所示。有研究表明Pb和Cd对淡水鱼类的HC5(基于保护95%生物的毒性阈值)分别为82.1和75.8 μg·L-1，而Pb对海洋全部物种(包括藻类、鱼类、甲壳类、软体动物、蠕虫和其他无脊椎动物等)的HC5值为234μg·L-1，本实验中Pb、Cd的离子浓度低于文献报道的HC5值[26-27]。河蚬暴露14 d时呼吸速率和对照组相比几乎没有变化，当Pb、Cd浓度分别为110、31.3 μg·L-1时对呼吸速率有轻微抑制。曾丽璇等[19]研究了重金属Cu和Cd对河蚬呼吸和排泄的毒性影响，结果表明，除100 μg·L-1处理组外，200、400 μg·L-1的不同重金属处理方式均对河蚬的耗氧率、排氨率产生抑制。暴露21 d结束时河蚬存活率没有明显降低。因此，本研究中所观察到的河蚬毒性主要是由沉积物中Pb和Cd所导致的，上覆水中重金属离子对其毒性的贡献较小。

2.3 酸可挥发性硫对重金属生物有效性的影响

沉积物中重金属的不同存在形态决定着重金属的污染程度，即决定着沉积物中金属的生物有效性[5]。而AVS是沉积物中重金属主要的结合态，对其生物利用起着决定性作用。研究表明SEM/AVS的摩尔比值与沉积物中重金属毒性相关，即当二价金属离子的含量高于沉积物中S2-时会引起毒性作用[28-29]。因而对沉积物中AVS和SEM进行分析测定，本研究中沉积物AVS含量、SEM含量与底栖生物的毒性效应见表4。AVS的含量在130～150 μmol·kg-1之间，且随着染毒浓度的增加呈现小幅增长趋势，SEM值随着染毒浓度的增加而增大，两者SEM值均远低于染毒的目标浓度。

图3 上覆水中Pb、Cd离子对河蚬的毒性效应

河蚬的呼吸速率随着SEM/AVS值的增大而逐渐降低。当SEM/AVS>1时，呼吸抑制率明显增加，这说明AVS确实是控制沉积物中重金属毒性效应的重要因素。河蚬的呼吸抑制率和SEM/AVS值的线性拟合如图4所示，进一步说明该比值可以较好的描述沉积物中重金属的生物可利用性(R2值分别为0.906、0.952，P值均小于0.01)。当SEM/AVS值增大时导致生物体内重金属的富集量增加。有研究表明[30-31]，随着重金属在河蚬体内的富集，内脏器官表面由有规则的纵行排列的纹路变得粗糙、肿胀，出现不规则分布的孔洞以及肿大的峭状突起等变化；在污染物刺激下，活性氧等自由基在体内不断积累，导致细胞受到一定程度的氧化损伤，从而导致机体酶活性降低，而自由基积累，加剧了膜脂过氧化，使膜的结构和功能遭到破坏，因而引起一系列生理生化代谢紊乱，机体生理代谢功能降低，表现为河蚬耗氧率和排氨率的降低。由图5可知，当SEM/AVS值低于1时，和空白组生物呼吸速率相比，Pb没有显著性差异，但是Cd却显示有生物毒性(P<0.05)，而且随着SEM/AVS值的增大，毒性效应也增大，当SEMPb/AVS≥4.22，SEMCd/AVS≥0.16时，具有极显著性差异(P<0.01)。沈洪艳等[21]研究了沉积物中Cu、Cd、Ni、Pb、Zn对底栖生物淡水单孔蚓和伸展摇蚊的毒性效应，发现当SEM/AVS<1时，Cu、Ni、Pb、Zn 4种金属基本不对底栖生物产生毒性，而Cd仍然显示出较强的生物毒性。这些研究结果说明Cd 对底栖生物的毒性作用非常强。

AVS-SEM模型是一种有效的生态风险评估方法，但是仍具有局限性。AVS可能受pH、氧化还原电位、溶解氧浓度等环境条件的影响而变化[32]。有很多研究表明底栖无脊椎生物由于以沉积物颗粒(包括AVS结合态)为主要食物来源，即使在SEM/AVS<1条件下，仍然能够在体内积累一定量的重金属[33-36]。不同的重金属在生物体中的排出速率不同，毒性效应也不一致。Arini等[37]将淡水河蚬在含有工业Cd和Zn污染的河流里暴露24 d后转移到清水中进行为期1年的排出实验。结果表明，组织中的Zn能够快速消除，但是Cd具有高持久性，其半衰期约为240 d。因此，与AVS结合态的Cd仍能够在生物体内蓄积，引起生物毒性。

表4 沉积物中AVS、SEM测定结果Table 4 Concentrations of AVS,SEM in sediment of toxicity tests

图4 河蚬呼吸抑制率与SEM/AVS值的关系

图5 SEM/AVS对河蚬呼吸抑制率的影响

综上所述，沉积物中Pb、Cd对河蚬的21 d致死毒性比较低，但能够导致河蚬下潜率下降，而且随暴露浓度增高呈现增强趋势；对河蚬14 d呼吸速率有明显抑制，EC50分别为519和151 mg·kg-1。上覆水中Pb和Cd离子浓度较低，对生物毒性效应贡献较小。SEM/AVS值和河蚬呼吸抑制率有良好相关性，当该比值大于1时，沉积物中的Pb对河蚬有生物毒性；小于1时，Pb对河蚬没有毒性作用。对于Cd而言，该比值>0.16时即对河蚬呼吸速率产生明显抑制作用。

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Toxicity of Pb/Cd-Spiked Freshwater Sediments toCorbiculafluminea

Han Yuwei,Zhang Yanfeng*,Chen Meng,Zhong Wenjue,Zhu Lingyan

Key Laboratory of Processes and Environmental Criteria,Ministry of Education,Tianjin Key Laboratory of Environmental Remediation and Pollution Control,College of Environmental Science and Engineering,Nankai University,Tianjin 300071,China

20 January 2015 accepted 15 March 2015

The toxicities of Pb and Cd in fresh water sediment and overlying water were evaluated using Corbicula fluminea as test organisms.The toxicity endpoints were survival and respiratory inhibition rate.The objectives of this research were to investigate the toxic effects of the two heavy metals on benthic organisms and the effects of acid volatile sulfide (AVS) and simultaneously extracted metals (SEM).The results indicated that Pb/Cd displayed weak lethal toxicity to Corbicula fluminea with mortality less than 20% even exposed at 400 and 100 mgkg-1for 21 d.The values of EC50of respiratory inhibition rate of Pb and Cd in the 14 d tests were 519 and 151 mgkg-1,respectively.The contribution of overlying water to the total toxicity was negligible due to the low metal concentrations in the overlying water.A good correlation between the toxic effects of Pb and Cd on benthic organisms and SEM/AVS was observed.When SEMPb/AVS>1 and SEMCd/AVS>0.6,the two metals displayed obvious toxicities to Corbicula fluminea.Keywords: heavy metal; Pb；Cd；Corbicula fluminea; sediment; respiratory inhibition rate; acid volatile sulfide (AVS)

国家水体污染控制与治理科技重大专项子课题(No.2012ZX07501-003-04)

韩雨薇(1989- ),女,硕士研究生,研究方向为水环境质量基准与生态风险评价,E-mail: hyw0401@163.com；

*通讯作者(Corresponding author)，E-mail: zhangyf@nankai.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897.20150120003

2015-01-20 录用日期：2015-03-15

1673-5897(2015)4-129-09

X171.5

A

张彦峰(1977-)，男，博士，副教授，主要研究方向为环境科学，发表学术论文10余篇。

韩雨薇,张彦峰,陈萌,等.沉积物中重金属Pb和Cd对河蚬的毒性效应研究[J].生态毒理学报，2015,10(4): 129-137

Han Y W,Zhang Y F,Chen M,et al.Toxicity of Pb/Cd-spiked freshwater sediments to Corbicula fluminea [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2015,10(4): 129-137 (in Chinese)