用HPLC法测定4种牡荆属植物中黄荆子素的含量

舒志恒，李华强，李 清，董睿方，郑承剑*，秦路平*

（1.宁夏医科大学药学院生药学教研室，银川 750004；2.第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433；3.上海师范大学生命与环境科学学院植物学教研室，上海 200234）

用HPLC法测定4种牡荆属植物中黄荆子素的含量

舒志恒1，2，李华强2，3，李 清2，董睿方2，3，郑承剑2*，秦路平2*

（1.宁夏医科大学药学院生药学教研室，银川 750004；2.第二军医大学药学院生药学教研室，上海 200433；3.上海师范大学生命与环境科学学院植物学教研室，上海 200234）

目的：建立HPLC法测定4种牡荆属植物（黄荆、牡荆、单叶蔓荆和蔓荆）果实中黄荆子素（VNL）的含量，比较黄荆子素的含量异同。方法：采用Zorbax Extend C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），Extend-C18保护柱（12.5mm× 4.6mm，5μm）；以乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，0～18min 14.4%乙腈，18～30min 14.4%～17%乙腈，30～45min 17%乙腈；流速1.0ml/min；检测波长254nm；柱温30℃。结果：黄荆子素在14.2～455.0μg/ml范围内呈良好的线性关系，平均加样回收率为96.99%。黄荆子素的含量在牡荆属4种植物中存在差异，其中以黄荆子和蔓荆子中含量较高。结论：该方法准确、快速，操作简便，精密度高，重复性好，可用于4种牡荆属植物中黄荆子素的含量测定。

牡荆属；黄荆子素；含量测定；色谱法，高效液相

［Pharm Care Res，2015，15（4）：277-280］

牡荆属植物所含化学成分类型较丰富，主要含有二萜类、木脂素类和黄酮类化合物。其中木脂素类和黄酮类化合物被认为是该属植物的主要活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤及抗炎镇痛等多种活性［1］。近年来，针对牡荆属中的木脂素类成分的研究十分活跃［2-6］。本课题组前期曾对该属植物黄荆的干燥成熟果实（黄荆子）的药理活性和化学成分进行了系统研究，获得了一系列苯代萘型木脂素［4-6］。其中6-羟基-4β-（4-羟基-3-甲氧基苯基）-3α-羟甲基-7-甲氧基-3，4-二氢-2-萘醛（简称为黄荆子素，VNL，化学结构见图1）的含量较高，且被证实有显著的抗肿瘤、抗炎镇痛和抗氧化等活性［3，7］。近期，通过LC-MS检测证实，VNL广泛存在于黄荆、牡荆、蔓荆、单叶蔓荆4种植物的果实中。本课题组曾采用HPLC法测定了黄荆子中VNL的含量［8］，但牡荆属其他3种常用药用植物中VNL的含量测定方法及不同种间VNL含量异同未见报道。本研究建立了牡荆属4种常用药用植物中VNL的HPLC测定方法，为进一步建立以VNL为指标成分的牡荆属药材质量标准提供参考依据。

图1 黄荆子素（VNL）的化学结构Figure 1 Chemical structure of vitexdoin（VNL）

1 仪器和试药

1.1 仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Mettler AE分析天平［精度：0.01mg，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；HWS-24型电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）。

1.2 药材和试剂 黄荆V.negundoL.于2014年9月采自四川省简阳市；牡荆V.negundoL.var.cannabifolia（Sieb.et Zucc.）Hand.-Mazz.于2014年9月采自第二军医大学药用植物园；蔓荆V.trifoliaL.、单叶蔓荆V.trifoliaL.var.simplicifoliaCham.于2014年9月采自福建省福州市，经第二军医大学药学院生药学教研室秦路平教授鉴定。VNL对照品（第二军医大学药学院生药学教研室自制，经HPLC检测纯度＞98%）［4］；95%乙醇、甲酸为分析纯，甲醇、乙腈为色谱纯（国药集团化学试剂有限公司）；纯净水（杭州娃哈哈集团有限公司）。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 采用反相高效液相色谱Zorbax Extend C18柱（250mm×4.6mm，5μm），Extend-C18保护柱（12.5mm×4.6mm，5μm）；检测波长254nm；柱温30℃；进样量5μl，流速1.0ml/min；以乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相，梯度洗脱，0～18min 14.4%乙腈，18～30min 14.4%～17%乙腈，30～45min 17%乙腈，对照品及样品的HPLC谱图见图2。

2.2 溶液的制备 （1）对照品储备液：精密称取VNL对照品4.55mg，用甲醇溶解，定容至10ml容量瓶中，即得455.0μg/ml的VNL对照品储备液，置4℃冰箱保存备用。（2）供试品溶液：精密称取2.00g已干燥至恒重的样品粉末（已过24目筛），加入25ml 50%乙醇，于75℃水浴恒温回流提取1h。提取液过滤，滤渣重复提取2次，用适量体积的溶剂洗涤残渣，收集滤液，60℃减压浓缩，用50%乙醇转移至50ml容量瓶中，定容，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 线性关系以及检测限和定量限的考察 精密吸取2.2（1）项下对照品储备液适量，用甲醇稀释成浓度为455.0、227.5、113.8、56.9、28.4、14.2μg/ml的系列对照品溶液，用0.45μm微孔滤膜过滤，按2.1项下色谱条件进行测定，以进样浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：Y＝9.264 1X＋35.343，r＝0.999 8（n＝6）。结果表明VNL含量在14.2～455.0μg/ml范围内与峰面积线性关系良好。通过不断稀释对照品溶液浓度，得到VNL的检测限和定量限分别为0.055和0.182μg/ml。

2.4 精密度实验 精密吸取VNL对照品溶液5μl，连续进样6次，测得VNL含量的RSD为1.41%（n＝6），结果表明仪器具有良好的精密度。

2.5 稳定性实验 精密吸取供试品溶液（黄荆子）5μl，分别于放置0、2、4、8、12、16、24h后进样，测得VNL含量的RSD为0.38%（n＝7），结果表明供试品溶液在24h内稳定。

2.6 重复性实验 取同一批黄荆子样品，按2.2（2）项下方法制备6份供试品溶液，测得供试品溶液中VNL含量的RSD为0.82%（n＝6），表明本方法具有良好的重复性。

2.7 加样回收率实验 精密称取已知含量的黄荆子样品（2.534mg/g）6份，每份1.00g，精密加入VNL对照品适量，按2.2（2）项下方法制备供试品溶液，测定含量并计算加样回收率，结果为（96.99± 1.71）%。

2.8 样品测定 精密称取单叶蔓荆子、蔓荆子、牡荆子和黄荆子样品2.00g，按2.2（2）项下方法制备供试品溶液后按照2.1项下色谱条件分别进样测定，根据标准曲线计算VNL含量，结果见表1。

3 讨 论

图2 4种牡荆属植物果实中黄荆子素的HPLC谱图Figure 2 HPLC photograms of vitexdoin in the fruits of the four Vitexspecies

表1 四种牡荆属植物果实中黄荆子素的含量Table 1 The contents of vitexdoin in the fruits of the four Vitex species

作者考察了30%、40%、50%、60%、70%、80%乙醇作为提取溶剂对VNL提取率的影响。结果发现，VNL的提取量随乙醇浓度的增大，先增加后有所下降，在乙醇浓度为50%时达到最大值，原因在于VNL为中等极性成分，溶剂极性过低会造成其溶解度的下降。同时还比较了不同的提取温度（55、65、75、85、95℃）对提取率的影响，发现VNL的提取率在75℃时达到最高，此后升高提取温度，提取率变化不明显。考虑到提取温度过高时，VNL含有多个酚羟基，受热不稳定，另外乙醇溶液的挥发也会造成有机溶剂的大量损失。因此选择75℃作为本研究中样品的提取温度。本研究在选择流动相组成和确立洗脱梯度时曾参考文献［8］，按其方法测定4种牡荆属植物中VNL的含量，发现除黄荆外其他3种植物中目标物的分离效果并不理想。作者经过反复实验，最终确定梯度洗脱条件。此条件下4种牡荆属植物的供试品溶液基线平稳，目标物均得到良好分离，且重复性好。

样品测定结果表明，不同种间VNL含量存在较大差异，其中以黄荆子、蔓荆子含量较高，单叶蔓荆子次之，牡荆子中含量最低。有文献曾对黄荆子、蔓荆子、单叶蔓荆子、牡荆子的药理活性进行了比较，发现黄荆子的解热镇痛活性较强，而牡荆子效果最差［9］。本课题组前期一系列研究亦表明［4-7］，牡荆属木脂素类成分具有良好的抗炎、镇痛和抗骨质疏松活性，结合本研究中4种植物的VNL含量测定结果，推测该属植物药理活性强弱与木脂素类成分的含量相关。

［1］周 燕，何蓉蓉，邱 峰，等.牡荆属植物的研究进展［J］.中国实验方剂学杂志，2010，16（17）：229-233.

Zhou Yan，He RongRong，Qiu Feng，et al. Research advances inVitexL. ［J］. Chin J Exp Tradit Med Formuale，2010，16（17）：229-233. In Chinese with English abstract.

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Zheng ChengJian.Anti-inflammatory constituents and quality evaluation ofVitexnegundofruits［D］.Shanghai：Second Military Medical University，2010.In Chinese with English abstract.

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Content determination of vitexdoin in the fruits of four Vitexspecies by HPLC method

SHU ZhiHeng1，2，LI HuaQiang2，3，LI Qing2，DONG RuiFang2，3，ZHENG ChengJian2*，QIN LuPing2*
（1.Department of Pharmacognosy，School of Pharmacy，Ningxia Medical University，Yinchuan 750004，China；2.Department of Pharmacognosy，School of Pharmacy，Second Military Medical University，Shanghai 200433，China；3.Department of Botany，College of Life and Environmental Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China）

Objective：To establish a HPLC method for the determination and comparison of the content of vitexdoin（VNL）in the fruits of four relatedVitexspecies such asV.negundoL. ，V.negundoL. var.cannabifolia（Sieb. et Zucc. ）Hand. -Mazz. ，V.trifoliaL. var.simplicifoliaCham. andV.trifoliaL. .Methods：Analyses were performed on Zorbax Extend C18analytical column（250mm×4. 6mm，5μm）and Extend-C18guard column（12. 5mm×4. 6mm，5μm）. Mobile phase was composed of acetonitrile-0. 1%formic acid in gradient elution at a flow rate of 1. 0ml/min：0-18min 14. 4%acetonitrile，18-30min 14. 4%-17%acetonitrile，30-45min 17%acetonitrile. Detection wavelength was 254nm and column temperature was 30℃.Results：VNL displayed good linearity within the ranges of 14. 2-455. 0μg/ml and average additional recovery rate was 96. 99%. VNL content in the fruits of the four species varied considerably，with VNL contents inV.negundoL. andV.trifoliaL. being higher than those in the other two species.Conclusion：The HPLC method proves to be accurate，simple，rapid，precise and reproducible. It could be used for content determination of VNL in the fruits of the fourVitexspecies.

VitexL.；vitexdoin；content determination；chromatography，high performance liquid

R927.2 ［

］ A ［

］ 1671-2838（2015）04-0277-04

10.5428/pcar20150412

2015-03-27

］ 2015-07-10

国家自然科学基金（81102773，81473328），上海市科委项目（14401902500，14R21411600），上海市卫生系统新优青计划（XYQ2013100）

舒志恒（男），硕士生.E-mail：13817760547@163.com

郑承剑，E-mail：zhengchengjian@smmu.edu.cn；秦路平，E-mail：qinluping@126.com

［

［本文编辑］阳凌燕