芦荟中游离氨基酸的成分及含量的测定

高晓荣

(榆林职业技术学院，陕西 榆林 719000)

芦荟中游离氨基酸的成分及含量的测定

高晓荣

(榆林职业技术学院，陕西 榆林 719000)

采用水浸提法提取芦荟中游离氨基酸，通过正交优化试验选出浸提温度、时间、料液比及乙酸浓度的最佳指标。按上述优化条件制得游离氨基酸提取液，最后用氨基酸分析仪测出14种游离氨基酸，其总含量为17.12 mg·g－1。

芦荟;游离氨基酸;氨基酸分析仪法

芦荟是百合科多年生常绿草本植物，芦荟中含有多种功效成分，具有催泻、健胃、能便、消炎、抗菌等多种作用，最新研究表明芦荟中的活性成分对肿瘤细胞和艾滋病病毒也有抑制作用。国内研究芦荟历史较短，且主要是关于其自然分布、生境及栽培技术的研究，而芦荟的主要物质组成、有效活性生物成分及医疗生物应用方面的研究历史更短，且和国际差异较明显。芦荟含有大量氨基酸和多种有益元素，各种氨基酸组成比例和含量均衡［1］。因此检测芦荟枝茎和叶片游离态氨基酸的组成比例及相关含量，既为深入研究芦荟生物活性成分奠定良好基础，同时也为综合利用芦荟资提供一定的科学依据。

氨基酸分析技术在生命科学、食品科学、临床医学等领域研究中都起着至关重要的作用。氨基酸分析检测方法主要有分光光度法［2，3］、色谱法［4］、积分脉冲安培检测法［5］、毛细管电泳法［6］、氨基酸分析仪法［7］等，本实验采用氨基酸分析仪测定了芦荟中氨基酸的种类和含量。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

FA100－4B电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司);HH－S型恒温水浴锅(中国郑州长城科工贸有限公司);日立L－8900全自动氨基酸分析仪(日本日立公司);KQ3200型超声清洗超纯仪(昆山市超声仪器有限公司);L04－2型离心机(上海安亭科学仪器厂);RE型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 试剂

芦荟(市场采购)，无水乙醇(含量99%以上)，茚三酮，甲醇，冰醋酸，盐酸，硝酸均为分析纯。茚三酮溶液:准确称取5.0000 g茚三酮，溶于100 mL蒸馏水中，倾入250 mL容量瓶，用蒸馏水定容，摇匀，用G4砂芯漏斗过滤，滤液备用。

1.3 样品前处理

将芦荟茎叶用自来水洗净，切成条状，自然晾干，放入烘干箱50℃烘干2～3 d至水分完全挥发，将烘干的芦荟放入经粉碎机粉碎，最后放入研钵研磨成粉末，经多孔目筛得到芦荟粉，放入干燥器中贮存备用。

1.4 样品中游离氨基酸含量的提取

芦荟茎叶前处理后，采用有机溶剂提取法提取，对浸提所需时间、温度、有机溶剂乙酸浓度、及料液比进行单因素实验，针对实验的较好结果，采用正交优化试验(四因素三水平)，进一步优化实验条件。

1.5 测定方法

电子天平(±0.0001 g)精密称取粉碎并过60目筛芦荟粉1.0000 g置于具塞三角烧瓶中，同时加蒸馏水30 mL，分别置于50℃、60℃、70℃、80℃、90℃恒温水浴锅水浴浸提3 h，将三角瓶取出后趁热用抽滤机抽滤，残渣用分别用8 mL热水洗涤后抽滤，获得下清液并入滤液中，置冷后，用二次蒸馏水定容于100 mL容量瓶中。取20 mL滤液置于小烧杯中，用pH计和10%的盐酸缓冲液滴定，将其调节至pH=2～2.2。用水性滤膜过滤注射入样品瓶约2/3处，用阿拉伯数字标记样品瓶，放入全自动氨基酸分析仪测定其组分和相对含量。

2 结果与讨论

2.1 浸提体系温度对试验的影响

由实验结果可知，提取温度控制在50～70℃之间时，各组分氨基酸的含量相对较高，说明，温度越高，氨基酸越有利于提取，但是超过70℃后温度增加对于含量影响较小。因此从节约能源和实验结果上看提取游离氨基酸的温度控制在50～70℃。

图1 浸提体系温度对试验的影响

图2 浸提体系提取时间的影响

2.2 浸提体系提取时间的影响

精密称取样品1.0000 g置于具塞三角瓶中，加入30 mL蒸馏水，在60℃恒温水浴锅中分别水浴浸提1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h，将三角瓶取出后趁热用抽滤机抽滤，试验方法同1.5所述。

由试验结果可知(图2)，刚开始氨基酸含量随浸提时间增加而增加，特别是1～2 h之间，含量增加较快。到时间为2 h时，继续增加时间，含量变化不大，说明体系已经达到了平衡。因此，体系提取时间控制在2～3 h之间。

2.3 浸提体系液料比的影响

称取样品1.0000 g(2.4.1)置于具塞三角瓶中，分别加入20 mL、25 mL、30 mL、35 mL、40 mL蒸馏水，于60℃恒温水浴锅水浴浸提3 h，将三角瓶取出后趁热用抽滤机抽滤，试验方法同1.5所述。

图3 提取液料比的影响

由图3可知，提取液料比在1∶25～1∶35之间时，提取液中氨基酸含量较高，因此芦荟茎叶游离氨基酸提取的最适宜液料比1∶25～1∶35。

2.4 浸提体系乙酸浓度的影响

称取样品1.0000 g置于具塞三角瓶中，分别加入30mL 5%、7.5%、10%、12.5%、15%乙酸缓冲液，于60℃恒温水浴锅水浴浸提3 h，将三角瓶取出后趁热用抽滤机抽滤，试验方法同1.5所述。

图4 乙酸浓度的影响

由图4可知，乙酸缓冲液在7.5%～12.5%提取液中氨基酸含量较高，因此芦荟茎叶游离氨基酸提取的乙酸缓冲液最适宜浓度在7.5%～12.5%。

2.5 体系正交优化试验

正交优化法可以合理安排实验的科学分析实验，从而可以减少试验次数，缩短周期，并得到理想的结果。试验中根据因素的各水平之间极差的大小去确定主要因素。R大时，说明此因素是主要因素，反之，则为次要因素。最后从每种因素中选出最好水平，即可得到最优方案。

由上述实验所得数据得到正交试验的因素及水平，见表1。

正交表的特点是按排的试验方法具有均衡搭配特性，选择正交表的原则，应当是被选用的正交表的因素数与水平数等于或大于要进行试验的因素数及水平数，并且使试验次数最少。本实验采用四因素三水平的正交试验，正交表选用L9(34)正交表，即可按表进行9次试验。见表2。

表2 实验数据分析

由正交试验分析结果可知，影响样品氨基酸提取的因素中，主要影响因素是温度，然后依次为是时间、浸提料液比、体系乙酸浓度。试验中得到的优化的浸提条件是A2B3C1D1，即以提取温度60℃，提取时间2 h，料液比为1∶25，乙酸浓度为12.5%的提取液。将提取液调整pH值后上机测定。

2.6 回收率实验

在已测游离氨基酸含量的芦荟样品中加入标准液，按样品处理方法进行预处理进行测定，其加标回收率为88.7%～107.3%。

2.7 氨基酸含量测定

梯度洗脱，分离柱柱温 57℃，反应柱柱温135℃，缓冲液流速0.35 mL·min－1，茚三酮流速0.35 mL·min－1，检测波长570 nm，进样量20μL。

浸提实验结果表明，芦荟茎叶样品中游离氨基酸提取的优化条件为:浸提剂为12.5%乙酸溶液，浸提温度为60℃，料液比1∶25，浸提时间为2 h。在此条件下测定样品中游离氨基酸的含量为17.12 mg·g－1。

3 结论

用全自动氨基酸分析仪检测芦荟中游离氨基酸的种类及含量，该方法具有前处理简单、专一性强、重复性好、精确度高、操作简便、能方便地实现对多种氨基酸的同时分析的特点，适用于芦荟中游离氨基酸的测定并取得较好的结果。由实验结果知，芦荟中含有15种已知氨基酸，其中含有6种人体必需氨基酸，依次为:苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸，约占总游离氨基酸的44%。

［1］刘慧民，孙弘.芦荟不同品种中水解氨基酸的定性定量分析［J］.中国林副特产，2000，54(3):7－8.

［2］邱然，邱林友，李秋宇.活性炭纸脱色分光光度法测定食醋中的氨基酸［J］.中国调味品.2010(8):41－43.

［3］黄晓德，赵伯涛，钱骅.芦笋茎叶游离氨基酸的提取及含量测定［J］.中国野生植物资源.2006，25(4):61－63.

［4］刘荣森，杨虹琦，黄郁维，等.植物中游离氨基酸的提取、纯化及分析方法［J］.河南科技大学学报(自然科学版)，2007，6(3):67－69.

［5］蔡亚岐.阴离子交换色谱－积分脉冲安培法测定鱼粉和玉米粉水解液中氨基酸［J］.分析化学，2005，33(4): 475.

［6］章丽，刘松雁.氨基酸测定方法的研究进展［J］.河北化工，2009，32(05):27－29.

［7］莫润宏，汤富彬，丁明，等.氨基酸分析仪法测定竹笋中游离氨基酸［J］.化学通报，2012，75(12):1126－1131.

［责任编辑 李晓霞］

R28 TS207.3

A

1004－602X(2015)03－0046－03

10.13876/J.cnki.ydnse.2015.03.046

2015 -07 -09

高晓荣(1974—)，女，陕西子洲人，榆林职业技术学院讲师。