南海珊瑚内生细菌Pelomonas puraquae sp.nov(B－2)中环二肽类次生代谢产物研究*

邓 芸，胡谷平，陈小洁，刘炳新，代树文，何细新，张翠仙

(1.广州中医药大学中药学院，广东广州510006;2.中山大学化学与化学工程学院，广东广州510275)

海洋微生物由于其生存环境的特异性 (高盐、高压、低温、无光照)激活了其某些沉默基因［1］，诱导其产生独特的生物代谢途径，致使其产生结构各异、具有显著生理活性的次生代谢产物，为海洋药物先导化合物的发现提供重要来源。在前期实验研究中发现珊瑚内生细菌Pelomonas puraquae sp.nov(B－2)使真菌生长延迟，甚至死亡，同时药理活性研究表明该菌株具有较好的抗肿瘤活性［2］。基于此，对B－2的次生代谢产物进行研究，通过柱层析(硅胶、ODS和 Sephadex LH－20等)和HPLC分离纯化，得到8个单体化合物，经过NMR和MS及物理常数对照确定其结果依次为:环(羟脯－苯丙)二肽(1)、环(脯－酪)二肽(2)、环(苯丙－甘)二肽(3)、环(苯丙－ 丙)二肽(4)、环(丙－酪)二肽(5)、环(亮－ 甘)二肽(6)、环(甘－ 缬)二肽(7)、环(丙－缬)二肽(8)。所有化合物均为环二肽类且首次从该菌株中分离得到。研究表明此类物质具有抑菌、抗肿瘤，心脑血管系统及神经保护、脱瘾解毒等方面的重要生理活性［3］。

图1 珊瑚内生细菌Pelomonas puraquae sp.nov(B－2)中的环二肽化合物1，2，3，4，5，6，7，8Fig.1 Chemical structures of compounds 1，2，3，4，5，6，7，8 from coral-derived bacteria Pelomonas puraquae sp.nov(B－2)

1 实验部分

1.1 仪器与材料

仪器:GZX－9070MBE恒温培养箱 (上海博迅实业有限公司);超净工作台 (苏州净化设备厂);ER－120A电子天平 (日本 A＆D公司);HH-ZK6水浴锅 (巩义市予华仪器有限责任公司);DZ－900振荡器 (太仓市强乐实验设备厂);LXB75L型立式自动电热压力蒸汽灭菌器 (合肥华泰医疗设备有限公司);HYG-A全温摇瓶柜 (江苏常州三盛仪器制造有限公司)。AVANCE AV400超导核磁共振仪 (瑞士 Bruker公司);Varian INOVA500NB超导核磁共振仪 (美国Varian公司);VG ZABHS质谱仪 (美国 Finnigan公司);Orbitrap Elite高分辨质谱仪 (Thermo Scientific公司);LCQDE-CAXP高效液相色谱－质谱联用仪 (美国Finnigan公司);QuikSep制备型高效液相色谱仪(北京慧德易科技有限责任公司)。

试剂:蛋白胨、酵母膏、牛肉浸膏 (BR，广东环凯微生物科技有限公司);葡萄糖 (CP，天津市大茂化学试剂厂);海盐 (广州市荔水族科技有限公司);石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇(AR，天津市富宇精细化工有限公司);柱层析硅胶 (200～300目，青岛海洋化工厂)。

菌种:实验用微生物 Pelomonas puraquae sp.nov(B－2)由海南大学谢珍玉教授提供，中国科学研究院南海海洋研究所张长生研究员进行种属鉴定，样品保存于广州中医药大学中药学院海洋微生物实验室。

1.2 B－2细菌活化与发酵

将B－2接种到装有40 mL液体LB培养基(牛肉浸膏 w=3.0%、葡萄糖w=2.0%、酵母膏w=1.0%、蛋白胨w=0.05%、人工海水500 mL，加蒸馏水定容至1000 mL，pH=7.0)的100 mL三角瓶中，在28℃摇床中150 r/min培养2 d得种子培养液。吸取该种子液 (1.5 mL)于培养瓶中(每升加500 mL液体LB培养基)，28℃摇床培养7 d至菌株生长成熟，停止发酵 (共发酵培养200 L)。

1.3 提取分离

将菌液和菌体高速离心分离。发酵液浓缩至18 L，依次用等体积的乙酸乙酯 (EtOAc)、正丁醇 (n-BuOH)进行萃取，减压回收有机溶剂得到发酵液的EtOAc浸膏 (72.6 g)和n-BuOH浸膏(131 g)。菌体用甲醇浸泡提取3次 (每次浸1 d)，所得甲醇提取液减压浓缩共得到浸膏69 g;该浸膏用水涅溶至1 L，依次用等量的EtOAc和n-BuOH进行水分配萃取，减压浓缩提取液，得到菌体的EtOAc浸膏12.8 g和n-BuOH浸膏22 g。经TLC追踪发现发酵液与菌体的EtOAc二者成分相似，合并得EtOAc相浸膏 (85.4 g)。

EtOAc浸膏 (85.4 g)经硅胶柱层析分离，以PE/EtOAc体系(V(PE)/V(EtOAc)=1∶0、9∶1、4∶1、7∶3、3∶2、1∶1、2∶3、3∶7、3∶17、0∶1)洗脱，得到10个组分 (Fr1～Fr10)。其中Fr10(8.0 g)用硅胶柱层析以PE/EtOAc体系(V(PE)/V(EtOAc)=6∶1、4∶1、2∶1、1∶1、2∶3、1∶3、1∶5、0∶10)洗脱得到 6个流分(Fr10－1～ Fr10－6)。Fr10－2(1.0 g)用硅胶柱层析以PE/EtOAc体系(V(PE)/V(EtOAc)=17∶3、4∶1、3∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶4、0∶1)洗脱得到8个组分(Fr10－2－1～Fr10－2－8)。Fr10－2－3(85 mg)以 HPLC(V(MeOH)/V(H2O)=12∶88，t=9.041 s)分离纯化，得到化合物8(10 mg);Fr10－5(2.0 g)用硅胶柱层析以 PE/EtOAc体系(V(PE)/V(EtOAc)=4∶1、7∶3、3∶2、1∶1、2∶3、1∶3、3∶17、0∶1)洗脱得到7个组分(Fr10－5－1～Fr10－5－7)。Fr10－5－2(105 mg)以 HPLC(V(MeOH)/V(H2O)=12∶88，t=6.506、12.389、16.838、18.155、20.922、32.554 s)分离得到化合物 1(15 mg)、2(14 mg)、3(10 mg)、4(5 mg)、6(5 mg)、7(10 mg);Fr－10－6(0.8 g)用硅胶柱层析以PE/EtOAc体系(V(PE)/V(EtOAc)=4∶1、3∶2、1∶1、2∶3、1∶4、3∶17、0∶1)洗脱得到4个组分 (Fr10－6－1～Fr10－6－4)，其中 Fr10－6－2(75 mg)以 HPLC(V(MeOH)/V(H2O)=12∶88，t=10.291 s)分离得到化合物5(5 mg)。

1.4 物理常数和波谱数据

化合物1:白色粉末 (甲醇)，紫外灯254 nm下无暗斑，碘蒸气显棕黄色，分子式C14H16N2O3，1H NMR(400 MHz，MeOD-d4)δH:7.31 ～7.15(5H，m)，4.46(1H，d，4.2 Hz)，4.33(1H，dt，18.0，8.9 Hz)，4.26(1H，t，4.7 Hz)，3.75 ～3.60(1H，m)，3.21～3.08(1H，m)，3.19～3.08(2H，m)，2.05(1H，dd，13.1，5.9 Hz)，1.42～1.30(1H，m)。

化合物2:白色粉末 (甲醇)，紫外灯254 nm下有暗斑，碘蒸气显棕黄色，分子式C14H16N2O3，ESI-MS m/z:259 ［M－ H］－。1H NMR(400 MHz，Pyr-d5)δH:9.36(1H，d，3.1 Hz)，7.27(2H，d，8.3 Hz)，7.09(2H，d，8.3 Hz)，4.51(1H，dd，10.1，4.2 Hz)，3.66(1H，dt，11.6，8.5 Hz)，3.41(2H，ddd，17.2，10.1，4.9 Hz)，3.30(1H，dd，13.6，6.3 Hz)，3.16(1H，dd，13.6，4.2 Hz)，2.20～2.08(1H，m)，1.91～1.76(1H，m)，1.66～1.55(1H，m)，1.52～1.37(1H，m)。

化合物3:白色粉末 (甲醇)，碘蒸气显棕黄色，分 子 式 C11H12N2O2，ESI-MS m/z:203［M－ H］－。1H NMR(400 MHz，Pyr-d5)δH:9.29(1H，s)，9.01(1H，s)，7.24～7.45(2H，m)，7.26～7.19(3H，m)，4.59(1H，m)，3.96(1H，dd，17.2，3.2 Hz)，3.50(1H，17.2 Hz)，3.45(1H，dd，13.2，5.6 Hz)，3.29(1H，dd，13.2，4.4 Hz);13C NMR(100 MHz，Pyr-d5)δC:168.4(C)，166.7(C)，136.9(C)，130.7(2 CH)，128.7(CH)，127.2(2 CH)，57.3(CH)，45.0(CH2)，40.8(CH2)。

化合物4:白色粉末 (甲醇)，碘蒸气显棕黄色，分子式 C12H14N2O4，ESI-MS m/z:217［M－H］－。1H NMR(400 MHz，Pyr-d5)δH:7.67(1H，d，7.6 Hz)，7.39(1H，d，8.0 Hz)，7.14(2H，t，7.6 Hz)，7.07(1H，t，6.8 Hz)，4.34(1H，t，5.2 Hz)，3.78(1H，dt，14.4，8.0 Hz)，3.52(1H，dd，10.8，4.0 Hz)，3.22(1H，dd，10.8，3.6 Hz)，0.45(3H，d，3.6 Hz);13C NMR(100 MHz，Pyr-d5)δC:170.7(C)，169.7(C)，129.3(C)，125.9(CH)，122.6(CH)，120.3(CH)，116.3(CH)，109.4(CH)，57.6(CH)，51.5(CH)，30.9(CH2)，20.2(CH3)。

化合物5:白色粉末 (甲醇)，碘蒸气显棕黄色，分子式 C12H14N2O3，ESI-MS m/z:233［M－H］－。1H NMR(400 MHz，Pyr-d5)δH:11.32(1H，br s)，9.10(1H，s)，9.07(1H，s)，7.40(2H，d，8.4 Hz)，7.10(2H，d，8.4 Hz)，4.60(1H，m)，4.20(1H，m)，3.51(1H，dd，16.0，5.2 Hz)，3.30(1H，dd，13.4，4.2 Hz)，1.30(3H，d，7.2 Hz);13C NMR(100 MHz，Pyr-d5)δC:169.8(C)，168.8(C)，154.5(C)，132.8(2 CH)，129.3(CH)，115.6(2 CH)，60.3(CH)，54.7(CH2)，37.4(CH2)，17.0(CH3)。

化合物6:白色粉末 (甲醇)，碘蒸气显棕黄色，分子式 C8H14N2O2，ESI-MS m/z:169［M－H］－。1H NMR(400 MHz，MeOD-d4)δH:3.98(1H，d，17.8 Hz)，3.88(1H，s)，3.81(1H，d，17.8 Hz)，1.85－1.75(1H，m)，1.66(2H，m，4.1 Hz)，0.95(6H，t，6.9 Hz);13C NMR(100 MHz，MeOD-d4)δC:171.7(C)，169.1(C)，55.1(C)，45.5(CH)，44.0(CH2)，25.5(CH)，23.5(CH3)，22.3(CH3)。

化合物7:白色粉末 (甲醇)，碘蒸气显棕黄色，分子式 C7H12N2O2，ESI-MS m/z:155［M－H］－。1H NMR(500 MHz，Pyr-d5)δH:9.13(1H，s)，8.98(1H，s)，4.29(1H，d，17.5 Hz)，4.18(1H，dd，17.5，2.4 Hz)，4.06(1H，t，3.1 Hz)，2.56－2.47(1H，m)，1.11(3H，d，7.0 Hz)，1.05(3H，d，6.8 Hz)。

化合物8:白色粉末 (甲醇)，碘蒸气显棕黄色，分子式C8H14N2O2，ESI m/z:170。1H NMR(400 MHz，Pyr-d5)δH:9.18(1H，d，4.8 Hz)，8.95(1H，s)，4.33(1H，s)，4.17(1H，m)，2.66(1H，m)，1.69(1H，d，6.8 Hz)，1.17(1H，d，6.8 Hz)，1.13(1H，d，7.2 Hz)。

2 结果与讨论

1)化合物1:白色粉末 (甲醇)，紫外灯254 nm下无暗斑，碘蒸气显棕黄色。1H NMR(400 MHz，MeOD-d4)谱中δH7.31～7.15(5H，m)为1个单取代芳环上的氢信号，结合δH4.46(1H，d，4.2 Hz)、3.75～3.60(1H，m)、3.21～3.08(1H，m)，显示有苯丙氨酸片段;δH4.33(1H，dt，18.0，8.9 Hz)为连有羟基的叔碳上的氢信号，结合 δH4.26(1H，t，4.7 Hz)、3.19～3.08(2H，m)、2.05(1H，dd，13.1，5.9 Hz)、1.42～1.30(1H，m)显示含有羟脯氨酸片段。将1的NMR数据与文献 cyclo(Hyp-Phe)数据对照［4］，基本一致。故确定1为cyclo(Hyp-Phe)，即环 (羟脯－苯丙)二肽。

2)化合物2:白色粉末 (甲醇)，紫外灯254 nm下有暗斑，碘蒸气显棕黄色。ESI-MS m/z:259［M－H］－，相对分子质量为260。1H NMR中 δH7.85(1H，s)为1个酰胺氮氢质子信号，结合δH4.51(1H，dd，10.1，4.2 Hz)、3.66(1H，dt，11.6，8.5 Hz)2个叔碳上的氢信号。与1的NMR数据对照发现2含有比1少了1个连氧碳质子，而增加了 δH3.30(1H，dd，13.6，6.3 Hz)、3.16(1H，dd，13.6，4.2 Hz)亚甲基信号，推断2含有脯氨酸片段。将2的NMR数据与文献cyclo(Pro-Tyr)数据对照［5］，基本一致。故确定2为 cyclo(Pro-Tyr)，即环 (脯－酪)二肽。

3)化合物3:白色粉末 (甲醇)，碘蒸气显棕黄色。1H NMR谱中 δH9.29(1H，s)和 9.01(1H，s)为2个氮上的氢信号，同时13C NMR谱中δC168.4(C)、166.7(s)也证实结构中存在两个肽键，说明3可能是环二肽类化合物。7.24～7.45(2H，m)和7.26～7.19(3H，m)为典型单取代芳环上的质子信号，同时 δC168.4(C)、136.9(C)、130.7(2CH)、128.7(2CH)、127.2(CH)碳信号提示3同样含有苯丙氨酸片段;同时δH3.96(1H，dd，17.2，3.2 Hz)、3.50(1H，d，17.2 Hz)和δC166.7(C)、45.0(CH2)提示该化合物含甘氨酸片段。将3的NMR数据与文献cyclo(Phe-Gly)数据对照［6－7］，基本一致。故确定3为cyclo(Phe-Gly)，即环 (苯丙－甘)二肽。

4)化合物4:白色粉末 (甲醇)，碘蒸气显棕黄色。13C NMR(100 MHz，Pyr-d5)谱中 δC170.7(C)、169.7(C)为两个酰胺羰基碳信号，说明该化合物可能是环二肽类化合物。将4的NMR与3对照，发现低场质子信息基本一致，故确定苯丙氨酸残基存在。同时 NMR δH3.78(1H，dt，14.4，8.0 Hz)和 0.45(3H，d，3.6 Hz)和 δC57.6(CH)和20.2(CH3)提示4含丙氨酸片段。将4的NMR数据与文献cyclo(Phe-Ala)数据对照［7－10］，基本一致。故确定4 为 cyclo(Phe-Ala)，即环 (苯丙－丙)二肽。

5)化合物5:白色粉末 (甲醇)，碘蒸气显棕黄色。1H NMR(400 MHz，Pyr-d5)谱中 δH9.10(1H，s)和9.07(1H，s)为2个氮上的氢信号，同时13C NMR(100 MHz，Pyr-d5)谱中 δC169.8(C)，168.8(C)为两个酰胺羰基碳信号，说明其可能为环二肽类物质。其NMR数据与2对比发现十分相似，均存在酪氨酸残基。而δH4.20(1H，m)和1.30(3H，d，7.2 Hz)及 δC54.7(CH2)、17.0(CH3)说明结构中还存在丙氨酸片段。将5的NMR数据与文献cyclo(Ala-Tyr)数据对照［11］，基本一致。故确定5为cyclo(Ala-Tyr)，即环 (丙－酪)二肽。

6)化合物6:白色粉末 (甲醇)，碘蒸气显棕黄色。ESI-MS m/z:169［M－H］－，结合NMR数据推断其分子式为C8H14N2O2，不饱和度为3。1H NMR中 δH9.38(1H，br s)和9.16(1H，br s)为氮上的活泼氢信号，存在酰胺的活泼氢质子信息，δH4.34(1H，d，15.2 Hz)和4.25(2H，m)为氮杂环中叔碳上的质子信号，推测可能为环二肽类化合物。δH4.25(2H，m)的峰可知氨基酸片段中在六元环上含有亚甲基，推测可能含有甘氨酸片段。δH2.03(1H，m)和1.92(1H，m)为1个亚甲基上的2个质子信号且化学环境不同，结合δH1.80(1H，m)和0.89(3H，q，6.4，4.0 Hz)，可推断该化合物含异丙基片断。将6的NMR数据与文献cyclo(Leu-Gly)数据对照［12］，基本一致。故确定6为cyclo(Leu-Gly)，即环 (亮－甘)二肽。

7)化合物7:白色粉末 (甲醇)，碘蒸气显棕黄色。ESI-MS m/z:155［M－H］－，结合NMR数据推断其分子式为C7H12N2O2，不饱和度为3。与6相比，其分子质量相差14(一个CH2);且含有与61H NMR基本一致的甘氨酸片段信号。而δH1.11(3H，d，7.0 Hz，)和1.05(3H，d，6.8 Hz)为两个相邻的甲基信号，而2.56～2.47(1H，m)为一个支链上的叔碳信号，推断可能含缬氨酸片段。将7的NMR数据与文献cyclo(Gly-Val)数据对照［13］，基本一致。故确定7为cyclo(Gly-Val)，即环 (甘－缬)二肽。

8)化合物8:白色粉末 (甲醇)，香草醛浓硫酸不显色，茚三酮显色阴性。ESI m/z:170，与7相比相对分子质量相差15(CH3);1H NMR数据与7对比显示结构中含有缬氨酸残基。4.33(1H，s)、1.69(1H，d，6.8 Hz)显示结构中有丙氨酸残基。将化合物的NMR数据与文献cyclo(Ala-Val)对照［14－16］，基本一致。确定8为cyclo(Ala-Val)，即环 (丙－缬)二肽。

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