双相障碍患者HPA轴改变与血清蛋白表达谱差异研究*

程宇航 谢静 何山 田玉洁 马征 李文标

·论著·

双相障碍患者HPA轴改变与血清蛋白表达谱差异研究*

程宇航1谢静2何山1田玉洁1马征1李文标1

目的 探讨双相情感障碍（BD）患者丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）功能改变的血清蛋白质表达的差异。方法选取57例BD患者，根据有无HPA轴改变分为异常双相障碍组（异常组，22例）和正常双相障碍组（正常组，35例），采用弱阳离子交换（WCX）纳米磁珠捕获血清蛋白质组分，用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）检测蛋白质质谱。结果异常组患者血清差异蛋白分子降低，在异常组与正常组之间筛选20个差异表达蛋白分子（P＜0.05），8个差异蛋白峰为异常组患者特有表达。以质荷比为M4166.52、M6643.63、M6861、M10847.9的分子建立了诊断模型，其敏感性和特异性分别为86.4%和94.3%。结论双相障碍患者HPA轴功能异常，导致血清差异蛋白表达异常，可能有其特征性病理机制。

双相情感障碍 HPA 生物标志物 蛋白质组学 磁珠 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱

双相障碍（Bipolar Disorder，BD）是一种慢性复发性精神疾病，已具有某些躁狂和抑郁发作期为特征。是情感性精神障碍的一个亚型。该疾病预后不良，复发率、自杀率和自残率均很高，是一种严重的精神疾病。双相障碍病因尚未明确，可能与遗传因素、生物学因素和心理社会因素关系密切。多数研究显示双相障碍和神经内分泌功能失调有关，包括下丘脑-垂体-肾上腺轴（HPA）和下丘脑-垂体-甲状腺轴（HPT），其中，HPA轴功能失调是主要标志，包括中枢促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）分泌增多，精氨酸加压素的分泌异常，外周血皮质醇（CORT）和促肾上腺皮质激素（ACTH）的含量升高等［1，2］。HPA轴功能亢进可能导致HPT轴功能缺失［3］，情感障碍神经内分泌紊乱的确切机制目前还不是很清楚，受到检测技术手段的限制，临床上尚缺乏可靠的生物学诊断指标支持。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix Assisted Laser Desorption IonizationTime of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS）是一种重要的蛋白质组学技术，在许多疾病的蛋白质组学研究上发挥着非常重要的作用，已用于多种疾病的生物标志物探索及早期诊断［4～6］。前期，我们采用WCX纳米磁珠结合蛋白芯片阅读仪联用的蛋白指纹图谱技术，对双相障碍患者血清蛋白质组学进行初步研究，获得了与其他精神疾病有显著差异的蛋白质谱［7］，为情感障碍亚型特异性提供了生物学依据。进一步对HPA轴异常与正常的双相障碍患者血清差异蛋白进行分析，寻找有意义的差异蛋白谱峰，建立HPA轴异常的情感障碍患者血清蛋白诊断模型，为筛选情感障碍患者血清生物标志物提供一种新的途径。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2012年～2013年在北京安定医院住院的双相情感障碍患者。共57例，其中男27例，女30例；年龄18～50岁；病程3个月～12年，中位数为2.2年。依据国际疾病分类第十版（ICD-10）诊断标准，确诊入组双相情感障碍患者。近期内未使用激素及免疫调节剂，入组前1个月未服用抗精神病药物。患者无酒精依赖史、中枢神经系统器质性病变及心肝肾功能不全等重大躯体疾病史。分组标准：异常双相情感障碍组（异常组）22例（其中男10例，女12例），促肾上腺皮质激素（ACTH）及皮质酮（CORT）检测值有1项及以上异常者；正常双相情感障碍组（正常组）35例（其中男17例，女18例），ACTH及CORT检测值均在正常参考范围；ACTH参考范围0～37 pg／m l、CORT参考范围5～25μg／dl（AM）［8］。

1.2 实验方法

1.2.1 标本采集 （1）血清标本采集：于上午6～8点空腹采集患者全血5m l，置于真空负压管中，不加抗凝剂，室温静置1 h，2 000 g离心20 min，取上清液。分装在500μl的EP管中，－80℃冰箱保存。所有血清样本直至进行MALDI-TOF-MS前进行解冻。（2）血浆标本采集：于上午6～8点空腹采集患者全血3 m l，置于EDTA-3K抗凝管中，离心1 500 g／min，5 min，取血浆，置－80℃冰箱保存批量检测。

1.2.2 实验测定

1.2.2.1 ACTH及CORT测定 采用化学发光法进行检测，ACTH应用顺序免疫度量实验，CORT采用竞争法，由天津德普生物技术和医学产品有限公司提供检测试剂盒，测定仪器为IMMULITE 1000全自动化学发光免疫分析仪（美国DPC公司）。测定ACTH、CORT的批内变异系数均＜10%。

1.2.2.2 血清蛋白质谱分析 （1）制备样本：从－80℃冰箱取出血清，置于冰上融解。10 000 rpm离心20 min。取上清10μl与20μl的U9缓冲液（9 mol／L Urea，20 g／L CHAPS，10 g／L DTT，50 mmol Tris-HCl，pH9.0）混合。4℃振荡孵育30 min后，加入100 mmol／L醋酸钠缓冲液（pH4.5）370μl。（2）WCX纳米磁珠的活化：取WCX纳米磁珠混悬液50μl，用100μl醋酸钠缓冲液洗涤磁珠2次，5 min／次。（3）采用WCX纳米磁珠捕获血清蛋白：将100μl处理好的血清样品加入活化的磁珠中，振荡孵育1 h。放置在磁性分离板上2 min，弃上清液。加入100μl醋酸钠缓冲液洗涤2次，5 min／次。用10μl0.5%（v／v）的TFA洗脱磁珠5 min。取5μl洗脱液与等量的SPA溶液充分混合，吸取2μl混合物进行点样，室温下自然干燥，用PBSⅡ-c型MALDI-TOF-MS质谱仪（购自美国BioRad公司）检测血清蛋白组分，并绘制蛋白质指纹图谱。（4）芯片质控和重复性：每个芯片在实验过程中均随机加入1个血清质控样品（质控品由北京德易临床检验医学中心提供），蛋白质峰平均CV＜15%。

1.3 统计学处理 采用BioMarker Wizard 3.1软件及SPSS16.0软件对芯片检测得到的蛋白指纹图谱数据进行统计学处理。异常组与正常组之间的差异蛋白峰比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。以上述数据为基础，采用Biomarker Patterns S of tware 5.0（BPS）分析HPA轴异常情感障碍的生物标志物，并建立分类树模型。

2 结果

2.1 两组蛋白指纹图谱比较 检测57例BD样本，得到114个蛋白峰，有20个蛋白峰有显著性差异（P＜0.05）。见表1。

表1 筛选出的20个P＜0.05的差异蛋白分子（±s）

表1 筛选出的20个P＜0.05的差异蛋白分子（±s）

注：*为仅在异常组中检出的差异蛋白质点

M／Z异常组（n＝22）正常组（n＝35）t值P值M1147.07*4.23±2.82 2.62±1.64 2.159 0.042 M3326.41 2.26±2.41 4.04±3.01－2.080 0.043 M3827.15*4.50±2.92 3.08±1.81 2.049 0.046 M3899.39 5.08±4.66 8.32±4.94－2.199 0.033 M4166.52*0.97±1.10 2.96±3.45－2.915 0.006 M4486.08 6.01±4.93 16.30±10.44－4.571 0.000 M4804.58 4.90±3.85 7.77±4.64－2.274 0.029 M5929.00 20.15±11.73 31.16±17.28－2.590 0.013 M6445.62 9.52±11.38 21.20±15.27－2.747 0.009 M6643.63 20.93±18.88 38.41±16.68－3.291 0.002 M6861.00*1.95±1.81 5.06±3.82－3.777 0.000 M7793.51 12.02±9.40 24.13±18.65－2.955 0.005 M7942.19 3.26±3.03 8.17±7.24－3.249 0.002 M8355.33 0.77±0.82 1.42±1.18－2.215 0.032 M8716.21*21.78±18.05 32.51±17.14－2.022 0.049 M8941.33*2.67±3.35 6.43±4.91－3.103 0.003 M8967.17*1.20±1.10 2.82±2.50－3.103 0.003 M10847.9 0.53±0.49 1.19±0.59－3.923 0.000 M11708.0*1.50±1.05 2.23±1.18－2.129 0.039 M24041.8 2.80±2.07 4.43±2.79－2.098 0.042

图1 异常组与正常组患者的部分蛋白的典型图谱

图2 区分BD患者HPA轴异常的决策树

2.2 BD患者HPA轴异常血清蛋白标志物的筛选及诊断模型的建立 从20个差异蛋白分子中筛选出方差齐且P＜0.01的10个差异蛋白分子导入BioMarker Patterns S of tware Version 5.0（BPS）分析软件，筛选出M／Z为M4166.52、M6643.63、M6861、M10847.9蛋白峰为诊断HPA轴异常双相障碍的最佳标志物（图1）。以这4个差异蛋白建立了分类树模型（图2），敏感性86.4%，特异性94.3%，当满足蛋白峰强度M10847.9≤0.708291且M4166.52≤1.29514进入终节点1或M10847.9＞0.708291且M6861.00≤4.31954且M6643.63＞49.529进入终节点4时，则模型判断为HPA轴异常的BD。以敏感性为纵座标，1-特异性为横坐标，绘制ROC曲线图，曲线下的面积（AUC）为0.948，见图3。

图3 HPA轴异常BD诊断模型的ROC曲线

3 讨论

下丘脑-垂体-肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal，HPA）轴是神经内分泌免疫调节的重要轴路之一，其功能的变化直接影响着机体的健康状况，由各类应激因素引起的HPA轴功能紊乱，主要表现为HPA轴功能的亢进。近年研究表明，HPA轴亢进是导致糖尿病和抑郁症等多种疾病的主要发病机制之一［9，10］。临床研究发现，HPA轴异常的情感障碍患者病情有可能更重，HPA系统功能恢复与患者的疗效及预后密切相关［11，12］。关于HPA轴功能亢进的血清蛋白质组学特征，目前没有研究报告。本研究中，我们采用MALDITOF-MS和WCX纳米磁珠联用的蛋白质指纹图谱技术检测了57例双相情感障碍患者的血清低分子量蛋白指纹图谱。各样品的质谱范围均显示在2～20 kD之间。表明WCX磁珠对pH为4.5状态下血清中带正电荷的低分子量蛋白具有较好的捕获能力。对可检测到的114个蛋白峰的统计分析显示，异常组较正常组的患者间有20个蛋白峰存在显著性差异（P＜0.05），其中有10个差异蛋白表达下降（P＜0.01），而且异常组患者有特征性差异蛋白峰，它们是M1147.06、M3827.15、M4166.52、M6861.00、M8716.21、M8941.33、M8967.17、M11708.00。这些差异蛋白质点也没有在我们已经报道的正常人和其他精神疾病中发现［7］。表明这部分患者有不同于其他类型精神疾病的生物学特征，进一步追踪这些差异蛋白质点的变化可能有助于了解双相情感障碍的病理过程。Stelzhammer V等［13］研究了双相障碍与重症抑郁症死后脑垂体蛋白质组学，发现BD患者有大量阿片黑素促皮质激素原（POMC）和甘丙肽表达。POMC是垂体多种激素的前体，垂体前叶促肾上腺皮质激素细胞将POMC处理成ACTH和β-促脂素。推断垂体POMC的大量表达导致ACTH和CORT分泌增加，可能是双相障碍患者HPA轴功能紊乱的病理机制。研究发现外周血ACTH和CORT表达增高的双相障碍患者，表现出特征性的血清蛋白差异表达谱，推测HPA轴功能紊乱，导致蛋白质代谢发生障碍，实验结果支持下丘脑-垂体-肾上腺轴参与了双相情感障碍发病机制，其蛋白表达之间的相互作用应该是有前途的研究方向之一。

本研究发现双相情感障碍患者HPA轴异常血清差异表达蛋白质点，但因这些蛋白属低丰度蛋白，现有方法学分离和鉴定十分困难［14］，故没有进行鉴定。然而，正是这些低丰度蛋白带给研究者十分重要的信息，研究者尝试以4个差异蛋白分子构成的诊断模型（图2），其敏感性为86.4%，特异性为94.3%，ROC曲线显示AUC在0.9以上具有较高的准确性，说明诊断效果较好。其临床应用价值有待于大样本量的盲法验证、评估与修正。

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A study of the differences between serum protein expression profile and hypothalamus-pituitary-adrenal（HPA）axis in patients with bipolar disorder．

CHENG Yuhang，XIE Jing，HE Shan，et al．
Beijing Anding Hospital，Capital Medical University，Beijing 100088，China

Objective To explore the differences between serum protein expression pr of ile and hypothalamus-pituitary-adrenal（HPA）axis in patients with bipolar disorder（BD）.MethodAtotal of 57 patientswith BD were divided into exception group（22 cases）and normal group（35 cases）according to exception or normal function of HPA in the patients.The serum of two groupswas tested with weak cationic exchange（WCX）magnetic beads for constituents of serum protein and Martrix-Assisted Laser Desorption／lionization Time of Flight Mass Spectrometry（MALDI-TOF-MS）for the proteomics.ResultsThere were differences for 20 protein biomarker peaks between exception group and normal group（P＜0.05）and specific expressions for 8 protein biomarker peakswere found in exception group.The diagnosticmodelwas established based on thesemoleculeswith the mass-to-charge ratio of M4166.52，M6643.63，M6861 and M10847.9；it was 86.4%for the sensitivity and 94.3%for the specificity.ConclusionThere are some correlations between the dysfunction of HPA and the dysfunction of serum protein expression in patientswith BD and theremay be characteristic pathologicalmechanism between them.

Bipolar disorder Hypothalamus-pituitary-adrenal Biomarkers Proteomics Magnetic beads Martrix-assisted laser desorption／lionization time of flightmass spectrometry（MALDI-TOF-MS）

R749.4

A

2095－9346（2015）－06－0401－05

10.3969／j.issn.2095－9346.2015.06.001

2015－08－16）

首都卫生发展专项基金（编号：首发2011-2012-04）

1.100088 北京市，首都医科大学附属北京安定医院 2.中国协和医科大学北京协和医院