雌激素通过ERK-FAK信号通路调节MCF-7乳腺癌细胞失巢凋亡

何 艳，王丹丹，陈华妹，李勇杰，薛启祥，王旭东*

（贵阳医学院1.生理学教研室;2.病理生理学教研室，贵州贵阳 550004）

雌激素通过ERK-FAK信号通路调节MCF-7乳腺癌细胞失巢凋亡

何 艳1，王丹丹1，陈华妹1，李勇杰1，薛启祥2，王旭东1*

（贵阳医学院1.生理学教研室;2.病理生理学教研室，贵州贵阳 550004）

目的 探讨雌激素（E2）对MCF-7乳腺癌细胞抗失巢凋亡能力的影响及细胞外信号调节激酶（ERK）-局部黏着斑激酶（FAK）通路在其中的作用，以加深对E2促癌作用信号机制的认识。方法 用MCF-7乳腺癌细胞，聚甲基丙烯酸羟乙基酯（poly-Hema）涂层培养细胞诱导失巢凋亡，E2刺激及MEK和FAK抑制剂预处理细胞。用蛋白印迹法检测ERK和FAK磷酸化，台盼蓝染色细胞计数法检测细胞存活力，Hoechst荧光染色法验证细胞凋亡。结果用Poly-Hema悬浮培养可显著降低细胞存活力（P＜0.01），E2处理则可明显增强悬浮培养细胞的存活力（P＜0.05），同时减少细胞凋亡;E2可引起ERK和FAK磷酸化，MEK抑制剂则可显著抑制E2诱导的ERK和FAK磷酸化，并使E2处理的悬浮培养细胞存活率下降57.48%（P＜0.01）;FAK抑制剂能明显抑制FAK和ERK的磷酸化，同时使E2处理的悬浮培养细胞存活率下降53.59%（P＜0.01）。结论 E2可明显提高MCF-7乳腺癌细胞对抗失巢凋亡的能力，该细胞保护效应可能与E2激活胞内ERK-FAK信号活动有关。

雌激素;细胞外信号调节激酶;局部黏着斑激酶;失巢凋亡;乳腺癌细胞

*通信作者（corresponding author）:xdwang@gmc.edu.cn

雌激素（17β-estradiol，E2）是促进激素依赖性乳腺癌恶性演进的重要因素［1-2］，其作用涉及核内和核外两条途径［3］。对细胞死亡刺激抵抗力增强是肿瘤细胞的重要生物学特性之一［4］。乳腺癌细胞从原位癌灶脱落后，对抗失巢凋亡（anoikis）的能力是影响脱落细胞能否在远处组织或器官形成转移灶的重要前提［5］。E2调节细胞周期蛋白E（cyclin E）基因和蛋白表达以及翻译后剪切修饰可能与其促癌作用有关［6］。然而，关于E2对乳腺癌细胞失巢凋亡的影响及其信号机制，目前尚不十分清楚。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系:人乳腺癌细胞系MCF-7（中国科学院昆明细胞库）。

1.1.2 主要试剂和抗体:DMEM、胎牛血清 （FBS）（HyClone公司）;活性炭处理胎牛血清（charcoalstripped fetal bovine serum，CS-FBS）（BioWest公司）;17β-雌二醇 （17β-estradiol，E2）、Poly-Hema、U0126及FAK抑制剂（Sigma-Aldrich公司）;抗FAK单克隆抗体（Millipore公司）及抗GAPDH抗体（Cell Signaling公司）;羊抗小鼠IgG-HRP抗体（武汉博士德公司）;RIPA裂解液、台盼蓝染色细胞存活率检测试剂盒及Hoechst33258（江苏碧云天公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及E2处理:MCF-7细胞用DMEM培养基（含10%FBS、1%青霉素及1%链霉素）在37℃、潮湿环境及5%CO2条件下培养（根据需要贴壁或poly-Hema悬浮培养，见下）。细胞汇合至50%～60%后，换以含无酚红DMEM+2.5%CSFBS培养24 h，再以无血清和无酚红DMEM继续培养24 h，以耗尽细胞内生性激素。

1.2.2 细胞悬浮培养及失巢凋亡的诱导:将poly-Hema按12 mg/mL溶解于无水乙醇中，0.2 μm过滤。溶解的poly-Hema按每孔1 mL铺于6孔板皿底、置于无菌操作台内过夜晾干。对数增殖期的MCF-7细胞消化、离心、计数（每孔30万个细胞/2 mL细胞重悬液），再按计算所得的DMEM重悬细胞，铺于上述晾干的poly-Hema的6孔板，给药培养24 h，然后进行细胞凋亡检测和细胞染色计数。

1.2.3 Hoechst荧光染色及细胞凋亡检测:培养细胞（悬浮细胞状态）收集在离心管里离心（1 000～2 000 ×g，离心约2 min）PBS重悬（50 μL）。细胞涂片（防脱载玻片），在空气中晾干。用免疫染色固定液，固定细胞60 min。洗涤1次（在空皿内加入PBS，载玻片放入1～2 min，取出），加入 Hoechst 33258染色液，室温、避光放置10 min。洗涤2次（方法同上），用抗淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察，使用激发波长为346 nm，发射波长为461 nm。1.2.4 台盼蓝染色及计数细胞:失巢凋亡诱导24 h后，进行台盼蓝染色并计算细胞存活率。用0.25%胰蛋白酶消化贴壁培养细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用100 μL细胞重悬液重悬细胞，加入100 μL台盼蓝染色液（×2），轻轻混匀，染色3 min，吸取少量经过染色的细胞，用血细胞计数板在显微镜（Olympus公司）下计数。细胞存活率计算公式:细胞存活率=（细胞总数－蓝色细胞数）/细胞总数×100%。

1.2.5 Western blot检测蛋白质表达:细胞处理24 h后，加入RIPA裂解液裂解细胞提取全细胞蛋白。样品离心后取上清留用，采用BCA法进行蛋白定量。每个泳道按30 μg蛋白质样品进行上样，SDSPAGE电泳分离蛋白，然后将分离蛋白电转移至PVDF;5%脱脂牛奶室温封闭1 h后，按要求加入相应抗体（1∶500～1000）室温孵育2 h或4℃孵育过夜;然后以TBST洗膜后加入相应辣根过氧化物酶标记二抗（1∶3 000）室温孵育1 h，PVDF膜以化学发光试剂盒进行显色。采用自动凝胶成像系统进行成像，GeneSnap软件分析蛋白印迹结果，目标蛋白的相对表达量以目标蛋白/内参蛋白吸光度的比值表示（n=3）。

1.3 统计学分析

采用SPSS11.5统计软件对实验数据进行统计学分析。数据以均数±标准差（±s）表示，实验结果各组间比较若方差齐且符合正态用t-检验，不符合条件者用秩和检验。

2 结果

2.1 E2增强MCF-7细胞的抗失巢凋亡能力伴随ERK及FAK磷酸化增强

与贴壁培养比较，poly-Hema悬浮培养可显著降细胞的存活率（图1A）;E2可明显增强细胞存活率（图1A）及减少细胞凋亡（图1B），E2还可增强ERK和FAK磷酸化（图1C）。

2.2 抑制ERK激活可阻断FAK磷酸化并削弱E2的抗凋亡效应

与对照组（DMSO）比较，E2处理可显著增强ERK和FAK的磷酸化，而以MEK抑制剂U0126预处理细胞则E2诱导的ERK和FAK磷酸化均受到显著抑制（图2A），同时E2的抗凋亡作用也明显减弱（图2B）。台盼蓝染色细胞计数显示，对照组（E2）细胞存活率为54.80±3.21，而E2+U0126处理组存活率为23.30±2.11，存活率下降57.48%（n=3，P＜0.01）。

2.3 FAK-ERK环路联系可能参与介导E2的抗失巢凋亡效应

FAK抑制剂（FI）不仅可抑制FAK磷酸化，还可阻止ERK的磷酸化（图3A，a蛋白印迹图，b目的蛋白相对水平直方图），同时FAK抑制剂还可明显减弱E2的抗凋亡作用 （图3B）。细胞计数显示，对照组细胞存活率为54.80% ±3.21%，而E2+FI处理组为25.43%±2.08%，后者存活率下降53.59%（n=3，P＜0.01）。

3 讨论

图1 E2对乳腺癌MCF-7细胞抗失巢凋亡能力及ERK和FAK磷酸化的影响Fig 1 Effects of E2 on the resistance to anoikis and phosphorylation of ERK/FAK in MCF-7 breast cancer cells

图2 MEK抑制剂对FAK磷酸化及E2增强MCF-7细胞抗失巢凋亡能力的影响Fig 2 Effect of MEK inhibitor on the phosphorylation of ERK and E2-enhanced resistance to anoikis in MCF-7 cells

图3 FAK抑制剂对ERK磷酸化及E2抗失巢凋亡效应的影响Fig 3 Effect of FAK inhibitor on the phosphorylation of ERK and the resistance to anoikis in MCF-7 cells

失巢凋亡是细胞与胞外基质或相邻细胞脱离接触而诱发的程序性细胞死亡，在机体发育、组织自身平衡、疾病发生和肿瘤转移中起重要作用。肿瘤转移是一个复杂的多步骤生物学过程。肿瘤细胞从原发灶脱落转移过程中，能够对抗因细胞失去黏附而引起的失巢凋亡［4-5］。现有研究显示，E2可增强鳞状上皮癌细胞的抗失巢凋亡和侵袭能力［7］，还可增强薯球蛋白裸细胞的存活力并促进其向肺部转移［8］。此外，上皮生长因子（epithelial growth factor，EGF）也可减少上皮细胞的失巢凋亡［9］。本研究显示，E2可明显增强MCF-7细胞在悬浮培养状态下的存活力和对抗失巢凋亡的能力;E2还可明显增强ERK和FAK磷酸化，提示ERK-FAK通路可能参与介导E2对乳腺癌细胞失巢凋亡的影响。

细胞丝裂原E2和EGF均具有促癌效应，EGF增强细胞抗失巢凋亡能力可能与锚定在细胞膜上的肝素结合的EGF样生长因子的自分泌和旁分泌及PI3K信号通路调控细胞凋亡和存活信号活动有关［9］。E2是公认的包括乳腺癌在内的激素依赖性肿瘤的重要刺激因素之一，但作用机制尚未完全明了。新近报道，E2可通过调控周期蛋白表达和剪切修饰而刺激乳腺癌细胞增殖和迁移［6，10］。E2可提高鳞状上皮细胞癌的存活力及对抗失巢凋亡［7］。有资料显示，乳腺癌细胞抗失巢凋亡能力增强可能与ERK信号活动增强有关，抑制ERK磷酸化可恢复肿瘤细胞对失巢凋亡的敏感性［11］。局部细胞黏着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）也与失巢凋亡有关［12］，并且与 ERK 之间具有密切联系［13］。本研究采用ERK上游激酶MEK抑制剂U0126以阻止ERK的磷酸化激活，发现E2诱导的FAK磷酸化激活受到显著抑制，说明E2诱导的FAK磷酸化为ERK依赖性;而抑制FAK磷酸化也可明显抑制E2诱导的ERK磷酸化，提示在雌激素信号通路中可能存在ERK-FAK正反馈环路。同时，抑制ERK或FAK磷酸化均可明显抑制E2的抗失巢凋亡作用。这些结果提示，E2可通过激活胞内ERK-FAK环路活动而增强MCF-7细胞的抗失巢凋亡能力，该效应可能涉及E2的核外作用机制［3］。在E2的刺激作用下，ERK-FAK信号活动增强，促进细胞对抗失巢凋亡及提高存活力，从而有助于肿瘤原发灶脱落的肿瘤细胞容易到达远处器官并继续增殖形成转移灶。因此，细胞内ERK-FAK信号通路中的关键分子可能成为抑制乳腺癌转移的药物作用靶点之一。

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Estrogen regulates anoikis through extracellular signal-regulated kinase（ERK）-focal adhesion kinase（FAK）signaling in MCF-7 breast cancer cells

HE Yan1，WANG Dan-dan1，CHEN Hua-mei1，LI Yong-jie1，XUE Qi-xiang2，WANG Xu-dong1*

（1.Dept.of Physiology;2.Dept.of Pathophysiology;Guiyang Medical University，Guiyang 550004，China）

ObjectiveTo investigate the effects of estrogen（E2）on the resistance to anoikis and a possible role of extracellular signal-regulated kinse（ERK）-focal adhesion kinse（FAK）signaling in the effect of estrogen to understand its underlying mechanism.MethodsPoly-Hema-coated culture of human breast cancer cell line MCF-7 was used to induce anoikis.Cells were treated with E2 and/or pretreated with MEK or FAK inhibitors.Western blot was used to assess the phosphorylation of ERK and FAK，trypan blue staining and cell counting were employed to evaluate cell viability，and Hoechst staining was used to check apoptosis.ResultsSuspension culture greatly reduced cell survival（P＜0.01），and exposure of MCF-7 cells to E2（10 nmol/L）led to a significantly increased resistance to anoikis and survival（P＜0.05）as compared to DMSO.Meanwhile，E2 induced increased phosphorylation of both ERK and FAK.Pharmacological inhibition of MEK with U0126（10 μmol/L）reduced E2-increased cell survival by 57.48%（P＜0.01）and E2-decreased anoikis;Treatment with FAK inhibitor（10 μmol/L）

attenuated E2-enhanced cell survival by 53.59%（P＜0.01）and E2-reduced apoptosis.ConclusionsE2 contributes to the enhanced cell viability and increased resistance to anoikis in MCF-7 breast cancer cells，and ERKFAK signaling may be involved in the E2-stimulated survival during suspension culture of MCF-7 cells.

estrogen;extracellular signal-regulated kinase;focal adhesion kinase;anoikis;breast cancer cells

R373.9

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.009

1001-6325（2015）09-1194-05

2014-12-23

2015-05-26

国家自然科学基金（31360252，30860093）