PLCε通过 PKCα/β/TBX3信号通路调控人膀胱癌细胞系T24的迁移和侵袭

欧俐苹，杜红飞，杨 雪，唐 敏，蔡晓钟，罗春丽

（重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学教育部重点实验室，重庆 400016）

PLCε通过 PKCα/β/TBX3信号通路调控人膀胱癌细胞系T24的迁移和侵袭

欧俐苹，杜红飞，杨 雪，唐 敏，蔡晓钟，罗春丽*

（重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学教育部重点实验室，重庆 400016）

目的 体外实验研究PLCε基因调节人膀胱癌细胞迁移和侵袭的分子机制。方法 设计并合成针对PLCε基因mRNA的寡核苷酸序列，构建重组腺病毒Ad-shPLCε。T24细胞感染Ad-shPLCε腺病毒后，用Western blot检测PKCα/β及TBX3、E-cadherin的表达;用划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验检测膀胱癌细胞T24的迁移、侵袭能力。结果 Ad-shPLCε重组腺病毒感染膀胱癌细胞T24，对其PLCε mRNA表达抑制率为75.6%，对其PLCε蛋白表达抑制率为67.4%。Ad-shPLCε感染组T24细胞迁移能力较空载组和空白对照组明显减弱（P＜0.05）;重组腺病毒Ad-shPLCε感染组T24细胞穿膜细胞数较空载组和空白对照组明显减少（P＜0.05）。Ad-shPLCε重组腺病毒感染膀胱癌T24细胞后下游PKCα/β的活化受到抑制（P＜0.05），同时，TBX3的表达减少，而E-cadherin的表达增高（P＜0.05）。结论 通过以重组腺病毒干扰抑制PLCε基因，能有效抑制膀胱癌T24细胞系中PLCε下游PKCα/β的活化情况及TBX3，E-cadherin的表达变化，并且对T24细胞的迁移、侵袭能力具有一定的抑制作用。

PLCε;PKCα/β;TBX3;膀胱癌;迁移

*通信作者（corresponding author）:luochunli79@hotmail.com

PLCε是2001年发现的一种磷脂酶C的同工酶，能被H-ras癌基因的蛋白表达产物（小G蛋白）和G蛋白双向调节［1-2］。H-ras基因突变广泛存在于人类实体瘤中，在结肠癌、乳腺癌、膀胱癌和胃癌等肿瘤中均发现有H-ras癌基因突变，并且其突变与某些肿瘤的分期和侵袭转移存在一定的相关性。PLCε具有调节 PKCα 活性的潜能［3］，抑制 PKCα/β的活性可抑制膀胱癌细胞的侵袭能力;TBX3可转录抑制E-cadherin的表达，而TBX3、E-cadheirn都被证实参与实体癌细胞迁移、侵袭能力的调节。因此，为明确PLCε调节膀胱癌迁移、侵袭能力的具体机制，本研究从体外实验观察PLCε基因对下游PKCα/β，TBX3，E-cadherin的表达影响，分析PLCε与PKCα/β表达和活性的关系。本研究以设计针对PLCε基因的短发夹状 RNA（short hairpin RNA，shRNA）表达载体，采用高效、特异的RNA干扰腺病毒沉默基因方法，通过腺病毒感染膀胱癌细胞系T24，以观察对该基因表达的调控作用并进一步观察对膀胱癌T24细胞转移侵袭力的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

膀胱癌细胞系T24（重庆医科大学附属第二医院超声研究所惠赠），RPMI1640培养基、胰蛋白酶（Gibco公司），胎牛血清（Hyclone公司）;Ad-shPLCε干扰腺病毒载体（武汉淅玛有限公司）;引物合成、反转录PCR试剂盒（TaKaRa公司）;山羊抗人PLCε多克隆抗体（SANTA CRUZ公司）;兔抗山羊IgG（北京中杉）;兔抗人 PKCα和兔抗人 PKCβ（Bioworlde），兔抗人 E-cadherin（Immunaway），兔抗人 TBX3（Proteintech）;Transwell小室及基质胶（B.D公司）。

1.2 方法

1.2.1 构建重组腺病毒及病毒感染:Ad-shPLCε干扰腺病毒载体和Ad-HK空载腺病毒载体（武汉淅玛有限公司构建）保存于－80℃。待细胞汇合度达70%～80%时分别加入适量Ad-shPLCε及Ad-HK腺病毒，设立空白组（blank组），Ad-HK空载组（Ad-HK 组），Ad-shPLCε 感染组（Ad-shPLCε 组）。

1.2.2 RT-PCR分析PLCε mRNA表达量:用Trizol分别提取各组细胞总RNA，取0.5 μg总RNA用于RT-PCR，方法参照反转录PCR试剂盒，引物序列为:PLCε上游引物5'-CATGGAAGGATAAGCGTTG GT-3'，下游引物 5'-CCCAAGTCCCGTGTTAAGA-3'，扩增片断为395 bp。以β-actin作为内参照，β-actin引物序列:上游引物5'-GGGACCTGACTGACTACC TC-3'，下游引物 5'-CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3'，扩增片断为543 bp。RT反应条件为:42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min;PCR反应条件:94℃灭活反转录酶2 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环，最后72℃再次延伸5 min。取5 μL PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，BIORAD分析电泳条带。对各条带吸光度值与β-actin条带吸光度值的比值进行分析，用A值比值的均数±标准差（±s）表示，n=3。

1.2.3 Western blot检测PLCε蛋白表达量:细胞裂解液裂解各组T24细胞，提取细胞总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度。分别取等量各组蛋白样品上样，经10%SDS-PAGE凝胶电泳后转 PVDF膜，PVDF膜用5%脱脂奶室温封闭2 h后依次加入1∶200 PLCε一抗和1∶5 000二抗，TBS洗膜后 ECL显色。结果采用半定量图像分析。对各条带吸光度值与GAPDH条带吸光度值的比值进行分析，用A值比值的均数±标准差（±s）表示，n=3。

1.2.4 观察重组腺病毒感染对T24细胞迁移侵袭能力影响

1.2.4.1 划痕实验:常规培养细胞于6孔板中，待细胞汇合度达70% ～80%，给予各种处理因素;待细胞长满6孔板时，于超净工作台内，用10 μL的枪头，十字交叉划线，划线后0、12和24 h时间点于显微镜下拍照;利用Olympus DP72软件分析细胞迁移面积。

1.2.4.2 Transwell侵袭实验:采用 Transwell小室体外侵袭实验，8 μm孔径聚碳酸酯微孔滤膜上均匀涂布一层1∶5稀释的人工基底膜Matrigel约40 μL/室，小室的上室分别加入各组 T24细胞悬液200 μL，细胞浓度均为5×105个/mL，每组细胞设3个复孔，测定各组细胞的侵袭力。每孔随机计数5个视野（×400），取平均值，以穿膜的肿瘤细胞数目多少作为评价其侵袭力的指标。

1.2.4.3 Transwell迁移实验:步骤同侵袭实验，去Transwell上室的基质胶，种植于Transwell上室的细胞数为1.5×104个。

1.2.4.4 Western blot检测下调PLCε 后 PKCα/β、TBX3和E-cadherin的活性:细胞感染腺病毒后，提取细胞膜、质蛋白及总蛋白，Western blot检测PKCα，PKCβ在细胞膜、胞质的分布及蛋白表达。PVDF膜封闭2 h后分别依次加入一抗（1∶1 000兔抗人PKCα或1∶1 000兔抗人PKCβ或1∶200兔抗人TBX3抗体或兔抗人 E-cadherin 1∶1 000）和1∶5 000二抗，TBS洗膜后ECL显色。结果采用半定量图像分析，方法同前。

1.2.4.5 QRT-PCR分析TBX3和E-cadherinmRNA表达量:用Trizol分别提取各组细胞总 RNA，取0.5 μg总RNA用于RT-PCR，方法参照QRT-PCR试剂盒，其中每组设置3个复孔，以β-actin作为内参，根据溶解曲线以2－ΔΔCt法计算基因表达定量结果。引物序列为:TBX3上游引物5'-TTCCACATTGTAA GAGCCAATG-3'，下游引物 5'-CTTTGAGGTTCGTTG TCCCTAC-3';E-cadherin上游引物5'-CGCCTTATG ATTCTCTGCTCGTGTT-3'，下游引物 5'-CGATTGCC CCATTCGTTCAAGTAGT-3'。以 β-actin作为内参照，β-actin引物序列:上游引物5'-CTGGAACGGT GAAGGTGACA-3'，下游引物 5'-AAGGGACTTCCT GTAACAATGCA-3'。

1.3 统计学分析

所有数据采用SPSS10.0进行方差分析，所有计量资料均用均数±标准差（±s）表示，组间均数比较采用q检验（SNK法）。

2 结果

2.1 重组腺病毒感染对T24细胞 PLCε基因的影响

2.1.1 RT-PCR检测PLCε mRNA的表达:PLCε mRNA在Ad-shPLCε腺病毒组细胞内表达明显低于空白对照和Ad-HK腺病毒组（P＜0.01）（图1）。以空白对照组PLCε mRNA表达值为标准，Ad-HK腺病毒组、Ad-shPLCε腺病毒组对目的基因表达抑制率分别为2.7%、75.6%。

2.1.2 Western blot检测PLCε蛋白的表达:结果显示感染Ad-shPLCε腺病毒组的比值明显低于其他两组（P＜0.01）（图2），其蛋白表达抑制率为67.4%。

2.2 重组腺病毒感染对T24细胞迁移侵袭能力的影响

图1 重组腺病毒感染各组T24细胞PLCε mRNA的RT-PCR结果Fig 1 RT-PCR analysis of the intracellular PLCε mRNA expression in all groups of T24

2.2.1 划痕实验、Transwell迁移、侵袭实验:Ad-shPLCε组T24细胞的迁移面积较空载组和空白对照组显著减少（P＜0.05）（图3）。在Transwell迁移、侵袭实验中Ad-shPLCε组T24细胞的迁移、侵袭细胞数较空载组和空白对照组显著减少（P＜0.05）（图 4）。

2.2.2 下调PLCε的表达抑制 PKCα/β的活性:感染 Ad-shPLCε组与 Ad-HK和空白组比较，shPLCε能够抑制 PKCα，PKCβ的活化，PLCε高表达的空白对照组，PKCα，PKCβ在细胞膜的分布较PLCε低表达的Ad-shPLCε腺病毒组更多，通过腺病毒感染后，PKCα，PKCβ在细胞膜蛋白内的表达较对照组降低（P＜0.05）（图5），PKCα，PKCβ 在胞质蛋白内的表达明显较对照组增高（P＜0.01）（图5）。

2.2.3 下调PLCε的表达抑制TBX3的表达和促进E-cadherin的表达:Ad-shPLCε组T24细胞的TBX3 mRNA及蛋白表达较空载组和空白对照组显著降低（P＜0.05）（图6）;Ad-shPLCε组T24细胞的E-cadherin的RNA及蛋白表达较空载组和空白对照组显著升高（P＜0.05）。

3 讨论

图2 Western blot检测T24细胞各组PLCε蛋白表达水平Fig 2 Western blot analysis of PLCε protein expression level in T24 groups

图3 划痕实验中T24细胞迁移能力Fig 3 The migratory ability of T24 in wound healing assay

图4 T24细胞的迁移、侵袭能力Fig 4 The migratory and invasive ability of T24 cells

图5 下调PLCε的表达抑制PKCα、PKCβ的活化Fig 5 Inactivation of PKCα/β by down-regulation of PLCε for T24 cells

图6 下调PLCε的表达抑制TBX3的表达和增加E-cadherin的表达Fig 6 Down-regulation of PLCε repressed TBX3 expression and increased E-cadherin expression for Western blot and QRT-PCR

PLCε是 Ras蛋白的效应分子并以GTP-依赖的方式被Ras调控。Ras突变激活PLCε后，PLCε定位于细胞膜并水解细胞膜上的磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）产生IP3和DAG两种重要的细胞内信使［1-2］。DAG可与Ca2+一起激活依赖 Ca2+、磷脂的蛋白激酶C（PKC），PKC激活后能使肿瘤细胞基质金属蛋白酶（MMPs）活性增高，该物质已成为研究肿瘤转移侵袭能力的靶点。PKCα总的表达水平及膜/质内表达比例在肿瘤组织中较正常组织中显著增高;随着肿瘤分级的增高，PKCα在膜内水平显著增高，而浆内水平却显著降低，总的表达水平相对增高［4］。这些研究表明Ras突变导致的PLCε/PKC信号活化在膀胱癌发生发展中起着重要作用。

PKCα的表达与膀胱癌的病理参数具有正相关性［5］;PKCα/β 抑制剂Go6976能够抑制膀胱癌细胞的侵袭能力［6］;本研究表明PLCε能够通过新的信号通路调节膀胱癌细胞的迁移、侵袭能力;下调PLCε的表达能够抑制PKCα、PKCβ的活性，能够抑制癌细胞的迁移、侵袭能力，充分证明PKCα/β为PLCε重要的下游分子及参与PLCε介导的膀胱癌细胞迁移、侵袭能力的调节。

TBX3作为转录抑制因子在多种实体癌中异常高表达，而大量研究表明TBX3的高表达与癌细胞的侵袭潜能相关。另外，TBX3能够抑制黏附分子E-cadherin的表达，进而调节癌细胞的迁移、侵袭功能［7］。E-cadherin是细胞与细胞黏附作用的重要调节者，在维持上皮细胞骨架的稳定中发挥重要作用。在肿瘤发生的晚期，可发生E-cadherin的低表达甚至缺失［8］。E-cadherin表达与肝癌侵袭能力呈负相关［9］，E-cadherin表达减弱，肝癌侵袭能力增强;癌旁组织中E-cadherin高表达，肿瘤发生转移的时间晚，概率低。本研究结果首次在膀胱癌中证实TBX3可转录抑制E-cadherin的表达;PLCε可通过TBX3介导E-cadherin的表达。另外，本实验结果显示通过下调PLCε而抑制PKCα/β的活性能够进一步抑制TBX3的表达，促进、诱导 E-cadherin的表达。PLCε/PKCα/β/TBX3/E-cadherin新通路的证实，为充分了解膀胱癌发病的病理机制奠定了坚实基础，为膀胱癌的临床治疗提供了新思路。

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PLCε regulates invasion and migration of human bladder cancer cells T24 through PKCα/β/TBX3 pathway

OU Li-ping，DU Hong-fei，YANG Xue，TANG Min，CAI Xiao-zhong，LUO Chun-li*

（Key Laboratory of Diagnostics Medicine Designated by the Ministry of Education，Laboratory Medical College，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

ObjectiveTo investigate the molecular mechanisms ofPLCε in regulating the invasion and migration of human bladder cancer cellsin vitro.MethodsAfter cells treated with recombinant adenovirus，the migratory/invasive abilities of T24 cells were explored by wound healing and Transwell chamber cell migration and invasion assay;RT-PCR was used to detect the mRNA levels ofPLCε;The protein levels of PLCε，PKCα，PKCβ，TBX3 and E-cadherin were determined by Western blot;QRT-PCR was used to detect the mRNA levels ofTBX3andE-cadherin.ResultsIt was confirmed by digesting and sequencing that the recombinant adenovirus had been constructed successfully.The expression ofPLCε mRNA and PLCε protein were both decreased after the infection of AdshPLCε.Wound healing and Transwell chamber cell migration/invasion assay showed that Ad-shPLCε treatment could inhibit the migratory and invasive activity of bladder cancer cells（P＜0.05）.The results of Western blot indicated that the expression of PKCα/β in membrane decreased（P＜0.05），and phosphorylation level of PKCα and PKCβ was reduced.QRT-PCR and Western blot analysis demonstrated that the expression level of TBX3 decreased，but the expression level of E-cadherin increased.ConclusionsPLCε shRNA can inhibit migratory and invasive ability of bladder cancer cells through PKCα/β/TBX3/E-cadherin pathway.

PLCε;PKCα/β;TBX3;bladder cancer;migration

R737

A

10.16352/j.issn.1001-6325.2015.09.001

1001-6325（2015）09-1155-07

2014-12-29

2015-03-26

国家自然科学基金（81072086）;重庆市教委自然科学基金（KJ110305）