五种鳞毛蕨科植物总黄酮含量及抗氧化活性分析

黄素楠，王 欣，曹建国，戴锡玲

（上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234）

五种鳞毛蕨科植物总黄酮含量及抗氧化活性分析

黄素楠，王 欣，曹建国，戴锡玲

（上海师范大学生命与环境科学学院，上海 200234）

采用铝盐显色分光光度法研究了5种鳞毛蕨科植物的总黄酮含量，并对其抗氧化活性进行分析.结果表明：所研究的5种鳞毛蕨科植物的总黄酮含量在5%～8%；狭顶鳞毛蕨的总黄酮含量最多（8.24%），其次是半岛鳞毛蕨（6.53%）和戟叶耳蕨（5.2%），变异鳞毛蕨（5.01%）和暗鳞鳞毛蕨（5.01%）的总黄酮含量最低；5种鳞毛蕨科植物的黄酮提取液具有良好的抗氧化能力，且提取的黄酮类化合物的添加量在实验剂量范围内与其抗氧化活性（铁还原力、DPPH自由基清除活性、ABTS+清除活性）呈正相关.为鳞毛蕨科植物资源的开发利用提供参考.

鳞毛蕨科；总黄酮；抗氧化活性

鳞毛蕨科植物次生代谢产物黄酮类化合物在改善记忆［1］、抗抑郁［2］、抗菌抑菌、增强免疫调节［3］、抗衰老和抗疲劳、诱导肿瘤细胞凋亡［4］等方面有广泛的应用，其具有的较强抗氧化活性可能是其发挥生理功效的药理基础［5］.人类为了维持自身的正常运转和健康状态，抵御各种自由基对组织的伤害，常需要自身产生或外界补充各种抗氧化剂.食品类抗氧化成分的种类和应用有限，合成抗氧化剂已被证实有致癌作用，安全性受到质疑［6］.近年来，从天然产物中寻找更加安全有效的抗氧化剂，已成为国内外越来越多学者的共同目标.目前，已对密果耳蕨、半育耳蕨、有盖肉刺蕨、联合鳞毛蕨、近川西鳞毛蕨、斜方复叶耳蕨、刺头复叶耳蕨、异鳞鳞毛蕨和阔鳞鳞毛蕨等9种鳞毛蕨科植物的总黄酮含量进行了测定，对鳞毛蕨科以外的铁线蕨、金星蕨、江南星蕨等黄酮提取物的抗氧化活性进行了提取研究［7-11］.

鳞毛蕨科植物有1 200余种，我国472种［12］.半岛鳞毛蕨Dryopteris peninsulae分布在辽宁、江西、湖北、云南东北部等地；狭顶鳞毛蕨D.lacera分布在黑龙江、浙江、湖南、四川等地；暗鳞鳞毛蕨D.atrata分布在长江以南各省区，东到台湾，北到甘肃，西南达西藏；变异鳞毛蕨D.uaria分布在陕西（佛坪）、江苏、湖北、广东等地；戟叶耳蕨Polystichum tripteron广泛分布于全国各地［12］.以上5种鳞毛蕨科植物均为广泛分布的常见种，资源较为丰富.

本研究提取鳞毛蕨科5种植物（半岛鳞毛蕨、狭顶鳞毛蕨、暗鳞鳞毛蕨、变异鳞毛蕨和戟叶耳蕨）的总黄酮，并通过对其总黄酮提取液的铁还原力、DPPH自由基清除活性、ABTS+清除活性的测定，研究其抗氧化活性，为进一步开发鳞毛蕨科植物的药用资源积累基础资料.

1 材料与方法

1.1 试剂和材料

1.1.1 材 料

5种鳞毛蕨科植物采自浙江西天目山，凭证标本保存在上海师范大学蕨类植物标本室.

1.1.2 试 剂

芦丁标准品（购自上海生物试剂二厂），NaNO2，Al（NO3）3，NaOH，乙醇，DPPH溶液，K2S2O8，ABTS，醋酸缓冲液，TPTZ，FeCl3溶液，FeSO4溶液，磷酸钠缓冲液，铁氰化钾（购自sigma公司）.

1.2 方 法

1.2.1 蕨类植物总黄酮的提取及含量测定

1.2.1.1 蕨类植物总黄酮的提取

将5种植物全株采集后清洗干净，自然晾干，75℃温度下于烘箱内烘干12 h，粉碎.分别称取5种植物干燥恒重样品1 g于小锥形瓶中，加50%乙醇25mL，50℃水浴2 h，超声20min，进行抽滤，滤液收集，再在滤渣中加入50%乙醇25 mL，50℃水浴2 h，超声20 min，进行抽滤，滤液收集，将两次滤液合并，弃滤渣，记录所得滤液的体积，测定滤液，即样液.

1.2.1.2 吸光度-芦丁标准曲线的制作

标准液的制备：准确称取120℃干燥恒重的芦丁20 mg，用95%乙醇溶解，定容至100 mL，摇匀得到浓度为2μg/mL的标准液.

标准曲线的制作：准确吸取标准液0、1、2、3、4 mL分别置于10mL容量瓶中，加水至5 mL，加5% NaNO20.3 mL摇匀，放置6 min，加5%Al（NO3）30.3 mL放置6 min，4%NaOH溶液4.4 mL，放置12 min.于510 nm波长处测定吸光度.绘制芦丁标准曲线，测得A=0.0084，B=10.255，相关系数R=0.995.

1.2.1.3 总黄酮含量的测定

精确吸取样液2mL于3支10 mL的试管中，加水至5 mL，再加5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min.加5%Al（NO3）3溶液0.3mL，摇匀，放置6min.加4%NaOH溶液4.4mL，放置12min，以试剂空白作对照，于510 nm波长处测定吸收度.查标准曲线，得到A、B值，而后计算出样液中总黄酮的含量.

计算方法：总黄酮含量=总黄酮的浓度×10/2×（材料提出的溶剂量）/1000×100%，

总黄酮浓度=（OD值的平均值-A）/B.

1.2.2 抗氧化活性实验

1.2.2.1 铁还原力的测定

取不同浓度5种植物的总黄酮提取液1 mL，与pH=6缓冲液2.5 mL，1%铁氰化钾2.5 mL混合后于50℃恒温水浴锅中水浴20 min，再加2.5 mL TCA溶液，于300 r/min离心机中离心10 min，分A1、A2两组，A1取上清液2.5 mL，加2.5 mL单蒸水和0.5 mL FeCl3，A2取上清液2.5 mL，加3 mL单蒸水，将A1、A2在700 nm下测吸光值.

还原能力=A1-A2.

1.2.2.2 DPPH（二苯基苦基苯肼）自由基清除活性的测定

分别取5、10、15、20、30、40μL总黄酮提取液加蒸馏水配成1 mL，设置对照组为只加1 mL蒸馏水，然后加入1 mL DPPH溶液，室温下保温30 min，在517 nm下测吸光值.

DPPH自由基清除活性（%）=［（A0-A1）/A0×100］，

A0是对照样品的吸光值，A1是样品或标准品的吸光值.

1.2.2.3 ABTS+（2，2-联氮基双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐）清除活性的测定

ABTS自由基溶液的制备：0.0132 g过硫酸钾加入20 mL含0.0768 g ABTS+的水溶液中，置于暗处16 h形成稳定的蓝色溶液.测定时，取2 mL该溶液加入约150 mL双蒸水中，使溶液于734 nm测得吸光值为0.700（±0.010）.将5种植物总黄酮提取液稀释20倍后，分别取30、50、70、90、110、130μL与蒸馏水配成150μL不同浓度稀释液加入3 mL ABTS溶液中，迅速测定吸光值，6 min后再次测定.

ABTS自由基清除活性（%）=［（A0-A1）/A0×100］，

A0是对照样品的吸光值，A1是样品或标准品的吸光值.

1.3 数据采集及分析

上述实验每种植物做3次重复，最终实验结果为3次实验测定的平均值.用SPSS 19.0软件对实验所得数据进行统计分析.

2 结果与分析

2.1 5种鳞毛蕨科植物的总黄酮含量

5种鳞毛蕨科植物中都含有黄酮类化合物，总黄酮含量在5%～8%之间；种间总黄酮的含量存在差异，其中含量较高的是狭顶鳞毛蕨（8.24%）和半岛鳞毛蕨（6.53%），其次是戟叶耳蕨（5.2%），含量较低的是变异鳞毛蕨（5.01%）和暗鳞鳞毛蕨（5.01%）.

2.2 5种鳞毛蕨科植物铁还原力分析

铁还原力测定原理为Fe3+可被样品中还原物质还原为Fe2+形式，呈现出明显的蓝色，并于700 nm处具有最大光吸收，根据吸光值的大小计算样品抗氧化活性的强弱［13］.从图1可以看出，所测5种鳞毛蕨科植物都存在一定的铁还原力，铁还原力达到25%时所需提取液的量各有差异.狭顶鳞毛蕨还原力达到25%时所需稀释20倍的提取液用量最少，为38μL；暗鳞鳞毛蕨还原力达到25%时所需稀释20倍的提取液用量最多，为81μL.在一定范围内，随5种鳞毛蕨科植物总黄酮浓度的增加，铁还原力逐渐增大.

2.3 5种鳞毛蕨科植物DPPH自由基清除活性

在DPPH自由基清除法中，DPPH可在有机溶剂中形成一种稳定的自由基，呈紫红色，且具有典型的特征吸收峰；当反应体系中存在抗氧化剂时，抗氧化剂提供氢原子和电子给DPPH自由基，使其生成无色产物，使溶液吸光值变小［14］.从图2可知，所测5种鳞毛蕨科植物都存在一定的DPPH清除能力.其中，半岛鳞毛蕨DPPH自由基清除活性达到50%时所需的提取液最少，为6μL，戟叶耳蕨DPPH自由基清除活性达到50%时所需的提取液最多，为19μL.在DPPH体系中，5种鳞毛蕨科植物总黄酮提取液中清除DPPH自由基的能力大小比较依次为，狭顶鳞毛蕨＞暗鳞鳞毛蕨＞变异鳞毛蕨＞戟叶耳蕨＞半岛鳞毛蕨，可见，它们清除DPPH自由基能力随总黄酮浓度的增加而增大.5种植物具有较好的抗氧化活性，在较低的浓度下自由基清除活性即可达50%以上，说明5种植物中所含黄酮是氢离子的良好供体，在体系中能生成稳定的DPPH-H化合物.

图1 5种鳞毛蕨科植物的铁还原力比较

图2 5种鳞毛蕨科植物对DPPH的清除能力比较

2.4 5种鳞毛蕨科植物ABTS自由基清除活性

在ABTS自由基清除体系中，ABTS+经氧化后生成相对稳定的蓝绿色ABTS水溶性自由基，抗氧化剂与ABTS+自由基反应后使其溶液褪色，特征吸光值降低.溶液褪色越明显则表明所检测物质的总抗氧化能力越强［14］.从图3看，所测5种鳞毛蕨科植物都存在一定的ABTS+清除活性.在ABTS+体系中，暗鳞鳞毛蕨ABTS+清除活性达到50%时所需的提取液最少，为98μL，戟叶耳蕨ABTS+清除活性达到50%时所需的提取液最多，在140μL以上.5种鳞毛蕨科植物总黄酮提取液中清除DPPH自由基的能力分别为暗鳞鳞毛蕨＞狭顶鳞毛蕨＞变异鳞毛蕨＞半岛鳞毛蕨＞戟叶耳蕨，且它们清除ABTS自由基能力随总黄酮浓度的增加而增大.

图3 5种鳞毛蕨科植物对ABTS自由基的清除活性比较

3 讨 论

黄酮类化合物广泛存在于鳞毛蕨科植物中，且在种间存在显著差异.已知文献中黄酮含量较高的是有盖肉刺蕨（5.88%），较少的为刺头复叶耳蕨（1.199%）［9-10］.本研究中狭顶鳞毛蕨和半岛鳞毛蕨的黄酮含量较有盖肉刺蕨高，其他3种植物也都在5%以上.可见，这5种植物是鳞毛蕨科中富含黄酮类化合物的良好资源.

根据本研究结果可知，总黄酮含量较高的狭顶鳞毛蕨和半岛鳞毛蕨的铁还原力、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力都较高；总黄酮含量较低的戟叶耳蕨和变异鳞毛蕨的铁还原力、DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力均较低.可见，黄酮类化合物的添加量在实验剂量范围内与其抗氧化活性呈正相关，与曹建国等［15-17］、张敏等［18］、刘冬梅等［19］和唐津忠等［20］的研究结果相一致.

在本研究中，总黄酮含量较低的暗鳞鳞毛蕨的DPPH自由基清除能力和ABTS自由基清除能力较高，分析可能是与黄酮提取液中的具体成分存在差异有关［6］.

黄酮类化合物在蕨类植物根、茎和叶中的含量尚有很大差异［18］.因此，可在后续的研究中分别提取5种植物根、茎和叶的总黄酮，并对其具体有效成分进行分离，为鳞毛蕨科黄酮类化合物的利用积累资料.

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Study on content and antioxidation activity of total flavonoids from five species of Dryopteridaceae plants

HUANG Su′nan，WANG Xin，CAO Jianguo，DAIXiling
（College of Life and Environmental Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai200234，China）

The content and antioxidation activity of total flavonoids extracted from 5 species of Dryopteridaceae plants were studied by aluminum color spectrophotometry.The results showed that the 5 species of Dryopteridaceae plants contained flavonoids，which content ranged from 5%to 8%.Dryopteris lacera appeared the highest total flavonoid content（8.24%）；D.atrata and D. uaria appeared the lowest（5.01%）.The total flavonoids content of Polystichum tripteron（5.2%）and D.peninsulae（6.53%）are in themiddle.The flavonoids extracted from the 5 species of Dryopteridaceae plants show a good antioxidant activity，and the content of flavonoids extracted from the plantswas in direct proportion to the antioxidation（Iron reducing power，DPPH free radical scavenging activity，ABTS+scavenging activity）.This paper is to provide a reference to the development and utilization of Dryopteridaceae plants.

Dryopteridaceae；total flavonoid；antioxidant activity

R 284

A

1000-5137（2015）05-0490-05

（责任编辑：顾浩然）

10.3969/J.ISSN.1000-5137.2015.05.006

2014-11-15

上海市自然科学基金（15ZR1430500）

戴锡玲，中国上海市徐汇区桂林路100号，上海师范大学生命与环境科学学院，邮编：200234，E-mail：daixiling2010@shnu.edu.cn