232例终末期肾功能衰竭患者HLA基因多态性分析

熊莉，孙瑜，肖莉，吴红，李国良

(江西省血液中心，江西 南昌330052)

终末期肾功能衰竭(ESRD)是各类原发的或继发的肾脏疾病发展到晚期的共同结果。有研究报道[1]HLA在ESRD的发生、发展中发挥重要作用。国外一些肾移植中心通过对ESRD患者HLA多态性的分析研究，认为HLA的表达及其多态性对肾脏疾病患者最终并发ESRD存在免疫遗传易感性和相对风险性。本研究对等待肾移植的232例江西籍汉族ESRD患者及2210例中国造血干细胞库江西籍汉族志愿捐献者的HLA基因分型进行比较，分析探讨终末期肾功能衰竭与HLA基因的关联性。

1 资料与方法

1.1 研究对象 病例组：2012-2013年在我中心做器官配型的江西籍终末期肾功能衰竭患者232例，均为汉族。男118例，女115例，年龄18~62岁，对照组：程良红等[2]研究的江西籍汉族骨髓供者2210例，性别、年龄与病例组相当。

1.2 基因组DNA提取 取乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝全血，用Texas基因组DNA抽提试剂盒分离获得，-20℃保存待用。。

1.3 HLA基因分型 运用序列特异性引物聚合酶链法，采用美国Texas Biogene公司试剂盒进行检测，具体操作按照说明书。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像仪观察结果。

1.4 统计学方法 利用SPSS 19.0软件计算基因频率及其风险关联系数(RR)、χ2和P值。若RR＞1，则认为该位点是疾病发生的危险因素；若RR＜1，则认为该位点在疾病发生过程中起保护作用。若RR=1，则表示该位点与疾病发生无相关性。HLA基因频率(GF)采用直接计数法，选择HLA抗原特异性作为计数标准。

2 结果

2.1 HLA-A位点基因频率 病例组HLA-A等位基因中，前 3 位依次是 A*11、A*02、A*24，对照组HLA-A等位基因中，前3位依次是A*02、A*11、A*24。HLA-A*11的基因频率病例组显著高于对照组(P<0.05)；HLA-A*31、A*33的基因频率病例组显著低于对照组(P<0.05)，其他组别差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 病例组与对照组HLA-A基因位点分析

2.2 HLA-B位点基因频率 病例组HLA-B等位基因中，前 3 位依次是 B*40、B*15、B*46，对照组HLA-B等位基因中，前3位依次是B*40、B*46、B*15。HLA-B*53、B*55的基因频率病例组显著高于对照组 (P<0.05)；HLA-B*58的基因频率病例组显著低于对照组(P<0.05)，其他组别差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 病例组与对照组HLA-B基因位点分析

2.3HLA-DRB1位点基因频率 病例组HLADRB1等位基因中，前 4位依次是DRB1*04、DRB1*09、DRB1*12、DRB1*15， 对 照 组 HLADRB1等位基因中，前 4位依次是DRB1*09、DRB1*12、DRB1*15、DRB1*04。HLA-DRB1*04 的基因频率病例组显著高于对照组(P<0.05)，其他组别差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

2.4 HLA基因与ESRD的发生风险 病例组较对照组HLA基因频率显著升高的有A*11、B*53、B*55、DRB1*04，相对危险率均大于 1(RR>1)；病例组较对照组HLA基因频率显著降低的有A*31、A*33、B*58，相对危险率均小于1(RR<1)。根据MH卡方检验，只有HLA-B*53在病例组与对照组中有统计学意义(P<0.05),提示HLA-B*53可能是终末期肾功能衰竭的易感基因。见表4。

表3 病例组与对照组HLA-DRB1基因位点分析

表4 HLA基因与ESRD的发生风险分析

3 讨论

HLA是控制机体免疫应答和免疫调节的重要系统，是人类发现的第一个与疾病有明确关联的遗传系统[3]。肾脏疾病患者并发终末期肾功能衰竭的发病机制尚未明了，一般认为多数是由免疫介导的炎症反应所致。据1998年统计，HLA与肾脏疾病的关联主要涉及7种疾病，相关联的HLA抗原达18种，它们在肾脏疾病的发生、发展及预后中起重要作用[4]。

有关HLA等位基因与肾脏疾病相关性的研究国内外已有报道，但由于地域、人种、样本大小及研究方法的不同，各家报道结果也不同。KARAHAN等[5]报道土耳其587例不同原发病最终并发终末期肾功能衰竭患者高表达HLA-B*58和HLA-DRB1*03，并认为易感基因的确定可能对延缓肾脏疾病向终末期肾病进展和预防移植后原发病再发的研究有重要意义。CRISPIM等[6]报道105例巴西籍等候肾移植的终末期肾功能衰竭患者HLA-A*78、HLA-DRB1*11抗原频率显著增加，HLA-B*14显著减少，提示HLA-A*78、DRB1*11可能是巴西籍肾脏疾病患者并发ESRD的易感基因。PEYMAN PD[7]等报道阿塞拜疆尿毒症患者HLA-A*1l、HLA-A*33和 HLA-B*49抗原频率与健康对照组相比显著升高，并指出携带易感基因的阿塞拜疆终末期肾病患者预后较差。刘伟等[8]研究发现 HLA-A*03、A*23、A*26、B*08、B*50、DRB1*04、DRB1*10对终末期肾功能衰竭患者有遗传易感性，HLA-A*01、A*11、B*13、B*46、DRB1*15、DQB1*09 则是这类患者的保护基因。HLA基因的地域差异性不仅表现在ESRD患者当中，其他疾病也有类似报道[9]。

本研究对232例江西籍汉族终末期肾功能衰竭患者以及2210例健康无血缘关系的江西籍汉族造血干细胞志愿捐献者进行HLA-A/B/DRBl基因分型，结果提示：病例组HLA-A*11、B*53、B*55、DRB1*04基因频率明显高于对照组，病例组HLA-A*31、A*33、B*58基因频率明显低于对照组(P<0.05)。本研究的结论与以往存在差异，这表明HLA与ESRD的关联性存在人群和地域特异性，因此，对不同地域的人群应作具体分析，不能将一个人群的研究结果直接应用于其他人群。

病例组中基因频率较高的分别为HLAA*11、A*02、A*24； B*40、B*15、B*46；DRB1*04、DRB1*09、DRB1*12、DRB1*15；其基因频率均大于10%。与本地区健康人群基因频率基本一致，因此，具有此类基因的患者在本地区找到合适的供体机会较大。

在研究HLA与疾病关系的文献中，部分作者仅根据病例组和对照组的HLA基因频率分布差异，计算出χ2值有统计学意义，就得出“易感基因”或“保护基因”的结论。笔者认为这种推断有失严谨，因为该χ2值的大小取决于HLA基因频率的大小和样本数量，它不能作为关联强度的量度。因此我们还需引进相对危险率 (RR)，即表示携带某HLA基因的个体发生ESRD的危险性是不携带该基因个体发生ESRD危险性的多少倍。只有RR的显著性检验有统计学意义，才可能推论该基因位点是否与疾病有关联性。本研究资料中，虽然根据χ2值 ，HLA-A*11、A*31、A*33、B*53、B*55、B*58和DRB1*04在病例组和对照组中的差异均有统计学意义，但是根据MH卡方检验，只能提示HLAB*53才可能是ESRD的易感基因。

由于病例组抽样人数有限，因此与对照组比较，病例组检出的等位基因数量偏少；另外，这种规模的样本计算低频基因往往误差较大；而且频率越小，误差越大，刘楠等[10]发现频率小于5%的等位基因，误差往往会超过频率的20%。HLA-B*53基因频率为0.43%，属于低频基因。笔者认为不可简单的将其定义为“易感基因”。综合统计分析的结果，我们最终认为终末期肾功能衰竭与HLA无明显相关性。

综上所述，了解HLA与ESRD的遗传相关性，不仅可为慢性肾病患者提供估计预后的指标，而且还能为等待肾移植的ESRD患者的供体选择提供参数，降低肾移植的风险。并且能对ESRD的辅助诊断、分类及制定防治措施等提供依据。因此，扩大病例组样本数量以及对导致ESRD的病因进行系统分类，是后续研究中亟需完善的工作。

[1]Franco C,Yoo W,Franco D,et a1.Predictors of end stage renal disease in African Americans with lupus nephritis[J].Bull NYU Hosp Jt Dis,2010，68(4):251-256.

[2]程良红,吴国光,李兴茂等.2210例江西籍汉族骨髓供者的HLAA、B、DRB1等位基因和单倍型频率[J].临床输血与检验,2012,8(1):5-11.

[3]Caillat-Zucman S．Molecular mechanisms of HLA association with autoimmune diseases[J].Tissue Antigens,2009,73(1):1-8．

[4]Lehnhardt M,Muchlberger T,Kuhnen C,et al.Feasibility of chemise nsitivity testing in soft tissue sarcomas [J].World J Surg Oncol,2005,3(20):1-12．

[5]Karahan GE,Seyhun Y,Oguz FS,et al.Impact of HLA on the underlying primary diseases in Turkish patients with end-stage renal disease[J].Ren Fail,2009,31(1):44-49．

[6]Crispim JC,Mendes-Junior CT,Wastowski IJ,et al.HLA polymorphisms as incidence factor in the progression to end-stage renal disease in Brazilian patients awaiting kidney transplant[J].Transplant Proc,2008,40(5):1333-1336．

[7]Peyman PD,Naser F,Mohammad N.Protective and susceptible HLA Class I gene in patients with End-stage renal failure[J].Res J Biol Sci.2008,3(11):1344-1346．

[8]刘伟,李代红.肾移植与HLA基因多态性的相关性［J］.广东医学,2013,34(9):1361-1364.

[9]杨宝成,王大明,高素青等.糖尿病视网膜病变与H LA-A、B和DRB1基因相关性的研究[J].实验与检验医学，2008,26(3):242-244.

[10]刘楠,袁方,梁飞,等.人类白细胞抗原多态性与慢性肾功能衰竭的遗传易感性研究[J].军事医学科学院院刊,2009,33(1):33-36.