福建省军团菌毒力岛magA基因携带情况分析

李曲文，郑恩惠，陈爱平，杨劲松，原灵，王灵岚

(1、福建省疾病预防控制中心，福建 福州350001；2、福建省人兽共患病研究重点实验室，福建 福州350001)

军团菌是一类革兰阴性菌，军团菌在许多环境中都很常见，目前已知的军团菌属有58个种70多个血清型，其中能引起人类疾病的大概有20种,致病性最强的为嗜肺军团菌[1-3]。军团菌的整个致病过程是其基因组上各个毒力基因及其表达产物共同作用的结果,不同军团菌的致病力强弱与其所带毒力因子不同有关[4,5]，有些毒力因子成为了近年来的研究重点和热点。本文利用PCR方法扩增2012-2013年30株军团菌菌株分析毒力岛magA基因携带情况，以初步了解我省分离株的毒力岛magA基因携带率。

1 材料与方法

1.1 实验用菌株 2012年-2013年福建省中央空调冷却塔水系统军团菌监测分离的菌株30株军团菌菌株。其中 16株 LP1，2株 LP4，3株 LP5，5株LP7，4 株 N-LP。

1.2 试剂仪器 Taq DNA聚合酶、dNTP购自大连宝生物工程有限公司，琼脂糖为BioAsia分装品。Gel Doc XR+凝胶成像系统，Basic电泳仪，PCR扩增仪为G-Storm(英国GeneTech公司)。

1.3 基因引物 本研究所用的基因引物序列magA基因：F:5’-CTCTATCGCTAACGCACAAGG-3’ R:5’-CGTTGAAGTAGTTAGTGAAAG-3’，参考文献[5],其相应的扩增片段大小为469bp，寡核苷酸由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 模板的制备 分纯的细菌菌落，直接刮取适量于300μl的纯水制备成菌悬液，100℃煮沸裂解10 min，10000r/min离心5min，取上清做为PCR检测的DNA模板。

1.5 PCR反应条件 PCR反应均采用20μl的反应体系，各组成成分的终浓度分别为：rTaq DNA聚合酶 0.5 U，dNTP 200μmol/L， 上游引物0.4μmol/L，下游引物 0.4μmol/L，DNA 模板 3μl。

2 结果

2.1 PCR结果 30株军团菌菌株magA基因PCR检测电泳结果，见图1。

2.2福建省30株军团菌magA基因携带率情况见表1。

图1 PCR电泳结果图

3 讨论

军团菌是一种兼性细胞内致病菌，军团菌属的致病性主要通过细菌的胞内生命循环过程、毒力岛基因座及毒力基因来完成。嗜肺军团菌的致病性与其毒力携带情况密切相关，毒力基因可以增加了细菌的生存的适应性，是细菌演变及其致病性的关键元素之一[6-8]。毒力岛作为细菌染色体上一段具有典型结构特征的基因簇,毒力岛的形成是通过细菌基因组水平的转移而改变其特性，可以增加细菌的适应性，是细菌演变及致病性的关键，与军团菌多种致病菌的毒力因子的产生和细菌的进化有着密切的联系[9-11]。嗜肺军团菌含有一个65kb的毒力岛,该毒力岛共含有约70个不同的基因。该基因座包含Ⅳ型分泌系统、易变遗传因子和毒力因子等，是嗜肺军团菌血清型1(LP1)所特有的[12]。

本研究选用毒力岛基因中间的magA(MIF associatied gene)基因作为检测毒力岛目的基因，magA基因是毒力岛70个基因中的第17个,它编码的20~24kDa的magA蛋白,据推测是表达军团菌在细胞内生长晚期的特异性蛋白,可以作为检测细菌在体内细胞中生长状态的有用标记物[13]。本实验不但检测了嗜肺军团菌LP1血清型毒力岛携带情况，同时还检测了14株非LP1型。根据实验结果显示16株LP1毒力岛阳性10株，2株LP4均阳性，5株LP7阳性3株，4株非嗜肺军团菌阳性1株。30株军团菌菌株毒力岛携带率为53.33%(16/30),说明了我省环境分离菌株具有较强的致病力，对环境有较好的适应性，可在外环境中长期存活。同时这些数据还表明毒力岛并不是嗜肺军团菌LP1所特有的，其他血清型也可携带。各部门应按照卫生部公共场所集中空调通风系统卫生规范[14,15]，加强中央空调冷却塔水监测，以防军团菌病的发生。

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