魔芋低聚糖对三硝基苯磺酸致小鼠溃疡性结肠炎的保护作用

冯 莉,安雪娇,齐 妍,刘 昱,赵方慧,张 波

(北京联合大学应用文理学院,生物活性物质与功能食品北京市重点实验室,北京 100191)

魔芋低聚糖对三硝基苯磺酸致小鼠溃疡性结肠炎的保护作用

冯 莉,安雪娇,齐 妍,刘 昱,赵方慧,张 波*

(北京联合大学应用文理学院,生物活性物质与功能食品北京市重点实验室,北京 100191)

目的:初步探讨魔芋低聚糖(KOGM)对三硝基苯磺酸(TNBS)诱导的小鼠溃疡性结肠炎的保护作用。方法:将昆明小鼠随机分为空白组、模型组、KOGM低剂量组和高剂量组。用100mg/kg bw TNBS和50%乙醇混合溶液造模。自造模24h后每天给小鼠灌胃KOGM直至处死。灌胃体积为10mL/kg bw。结果:各剂量组每日平均摄食量无显著性差异,但与模型组比较,低、高剂量组食物利用率和体重增重均显著升高;与模型组比较,低剂量组和高剂量组小鼠的结肠溃疡面积及溃疡率均明显降低(p<0.01);结肠组织病理切片结果表明,KOGM高剂量组小鼠受损结肠恢复较好甚至接近正常状态。结论:KOGM对小鼠溃疡性结肠炎有一定的保护作用,其作用机理需进一步研究。

魔芋葡甘露低聚糖，溃疡性结肠炎，小鼠，TNBS

魔芋葡甘露低聚糖(konjac oligo-glucomannan,KOGM)简称魔芋低聚糖,它是通过酶、酸、辐照等方法[1-3]降解天然魔芋葡甘露聚糖(konjac glucomannan,KGM)而得到的。KOGM的应用有效地解决了KGM粘度过高,溶解度过小,食用后难消化以及易引起腹胀等一系列问题;另外,KOGM有促进益生菌生长、抑制病原菌、调节免疫、降低肠道排泄物毒性以及抗氧化等保健功效[4-7],因而可作为理想的食品原料或食品添加剂。

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种结肠和直肠慢性非特异性炎症性疾病,病症多为大肠粘膜及粘膜下层浸润,典型临床症状是间歇性腹泻带血、里急后重等。近年来UC在我国的发病率呈逐年上升趋势。目前病因尚未十分清楚,且临床上尚无有效的UC治疗药物及方法,但有研究报道显示,UC可能与免疫、环境、遗传等因素有关[8-9]。2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid,TNBS)诱导的小鼠UC模型是目前比较公认的模型,该方法操作简便、效果明显且稳定性高。本文采用TNBS诱导小鼠溃疡性结肠炎,再灌胃不同剂量的KOGM,通过食物利用率、溃疡率及组织病理切片等指标,探讨魔芋低聚糖对结肠损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SPF级雌性昆明小鼠(25～27g,80只) 购于北京维通利华实验动物技术有限公司,使用许可证号为SYXK(京)2012-0031;魔芋低聚糖(KOGM) 成都永安制药有限公司,低聚甘露糖(甘露二糖-甘露十糖)含量(以干基计)≥85%,其中聚合度2-6的寡糖含量≥50%,国家卫生计生委2013年第10号公告批准为新食品原料;2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS) Aladdin试剂有限公司;无水乙醇 北京化工厂,分析纯。

表1 魔芋低聚糖对小鼠体重、摄食量及食物利用率的影响±s)Table 1 Effects of KOGM on the body weight,the food intake and efficiency ratio of the female ±s)

注:与TNBS模型组比较,*:p<0.05,**:p<0.01。

全自动组织脱水机(ASP200)、石蜡包埋机冷台(EG1150C)、石蜡包埋机热台(EG1150RH)、半自动轮转式切片机(RM 2245)、摊片机(HI1210)、烘片机(HI1220)及全自动染色机(AUTOSTAINER XL) 德国Leica公司;三目倒置摄像生物显微镜系统(IX71) 日本OLYMPUS公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物饲养与分组 动物饲养环境为SPF级动物房。人工控制温度为18～24℃,相对湿度为40%～70%,光照周期为14h光照(6:00 ～20:00)/10h黑暗,自由取食、饮水。普通饲料适应性饲养3d后,将80只健康小鼠随机分为4组,分别为空白组、模型组、KOGM低剂量组和高剂量组(低、高剂量分别为2、6g/kg bw),每组20只。造模前禁食24h,自由饮水。模型组、低剂量组以及高剂量组分别一次性灌肠100mg/kg bw TNBS和50%乙醇溶液混合液,即将浓度为5%的TNBS水溶液、无水乙醇按体积比为1∶1混合,灌肠体积为4mL/kg bw,空白组灌肠等体积50%的乙醇溶液。

1.2.2 TNBS诱导结肠炎模型 参考徐阳等[10]的小鼠TNBS结肠炎模型的建立方法。造模前称重,计算给药剂量。小鼠禁食24h后,先用2%的戊巴比妥钠,按2mL/kg bw腹腔注射麻醉小鼠,再用1mL连有灌肠针的微量注射器按体质量吸取灌肠液,小心将灌肠针探入小鼠肛门内,深至3～4cm,过程中避免碰伤肠壁,缓缓推入药液。灌肠完毕后缓慢拔出灌肠针,为确保致敏液与肠道充分作用,将小鼠头朝下,固定在一个45°角倾斜的平面上,静置30min后,再进行一次同样的给药操作。小鼠苏醒后,将小鼠放回笼中。空白组注入50%乙醇溶液。

1.2.3 魔芋低聚糖灌胃小鼠 灌胃前称重小鼠,计算给药剂量。自造模24h后,每天进行一次性灌胃KOGM,灌胃体积为10mL/kg bw。空白组及模型组均灌胃10mL/kg bw的去离子水。每天观察并记录动物的一般表现行为。每2天称体重和食物摄入量,计算食物利用率。

1.2.4 动物处理 灌胃10d后,分别称体重、摄食重。在第11d禁食16h后,称空腹体重,颈椎脱臼处死。称量胸腺、心、肝、脾、肾脏器绝对重量和计算脏/体比值。取结肠组织,用生理盐水将肠内容物冲洗干净,将每组中任意半数小鼠的结肠沿肠系膜剖开,用游标卡尺分别量取结肠总面积及溃疡面积,溃疡面积/总面积即为溃疡率;剩余小鼠分别截取横结肠中段1cm,浸泡于4%的福尔马林溶液固定24h,石蜡包埋,常规切片,HE染色,观察结肠组织结构。

2 结果与分析

2.1 魔芋低聚糖对小鼠体重、摄食量及食物利用率的影响

造模初期,造模组、空白组、KOGM低剂量组和高剂量组小鼠均出现懒动、少食、稀便、皮毛光泽度降低等症状,体重降低。第四天起,KOGM低剂量组和高剂量组小鼠基本恢复正常,空白组小鼠腹泻、懒动等症状逐渐减轻;小鼠体重显著增加,而模型组小鼠直到第五天体重才显著增加。实验结束时,与TNBS模型组比较,低剂量组和高剂量组小鼠的摄食量未见显著性差异,但体重增重以及食物利用率显著增加(p<0.05),提示KOGM能提高食物利用率,且这种作用与KOGM呈一定的剂量效应关系;另外,KOGM也有一定的增重效果,并且低剂量(2g/kg bw)作用更为明显。结果见表1。

2.2 魔芋低聚糖对小鼠主要脏器的影响

造模组、空白组、KOGM 低剂量组和高剂量组小鼠的胸腺、心、肝、脾、肾脏重以及相应脏器系数均无显著性差异,提示KOGM对小鼠的主要脏器没有负面影响。结果见表2、表3。

表2 魔芋低聚糖对脏器重量的影响Table 2 Organ weight of experimental mice

表3 魔芋低聚糖对脏器系数的影响Table 3 Organ index of experimental mice

2.3 魔芋低聚糖对实验动物结肠溃疡的影响

模型组的溃疡面积及溃疡率均显著高于空白组(p<0.01),表明造模成功。与模型组比较,KOGM低剂量组和高剂量组小鼠结肠的溃疡面积及溃疡率均显著降低(p<0.01),表明KOGM能改善小鼠结肠的溃疡状况,可能对UC有一定的治疗作用。结果见图1。

图1 魔芋低聚糖对结肠溃疡的影响Fig 1 The ulcer status of colons on the groups of mice注:与空白组比较,**:p<0.01; 与模型组比较,##:p<0.01。

2.4 魔芋低聚糖对结肠组织学的影响

空白组小鼠结肠结构清晰,上皮完整,腺管排列规则,无炎细胞浸润,杯状细胞分布连续。模型组小鼠结肠上皮缺失,腺管扭曲且广泛缺失,杯状细胞丢失,粘膜下层水肿并伴有大量炎细胞,表明造模成功。KOGM高剂量组小鼠结肠上皮较完整,腺管排列较规则,杯状细胞部分缺失,固有层有较少的炎细胞浸润,粘膜下层存在少量炎细胞,表明KOGM有助于使受损的结肠恢复正常,可能对UC有较好的治疗效果。结果见图2。

图 2 魔芋低聚糖对结肠组织学的影响Fig.2 Histological analysis of colons of the experimental mice注:A:空白组(×10);B:模型组(×10);C:高剂量组(×10); D:空白组(×20);E:模型组(×20);F:高剂量组(×20)。

3 讨论

UC在我国的发病率逐年上升,其临床症状轻重不一,以持续性肠道非特异性炎症为特征,通常反复发作,临床上无特效的治疗手段,给患者带来很大痛苦。采用非特异性抗炎和免疫抑制药物是目前治疗UC的主要方法,该法不良反应多,且无法根治。安全有效的疗法是医疗工作者一直以来共同的追求。因此,探究UC的治疗药物具有重要意义。

UC与免疫调节密切相关[11]。研究表明[12],KOGM可增强ICR小鼠的细胞免疫功能和单核巨噬细胞吞噬功能,从而发挥免疫调节功效。

目前,乳酸杆菌、双歧杆菌等益生菌对UC的辅助治疗作用已被多数人认可,许多研究者致力于肠道菌群和UC的相关机理研究。Zhao等[13]研究结果表明,Bifico胶囊(包括双歧杆菌、乳酸杆菌和肠球菌)能显著提高肠系膜淋巴结中的T细胞水平,调节结肠粘膜中Th1和Th2细胞因子的平衡,即使IL-2、IL-4和IL-10水平升高,使TNF-α和IFN-γ水平下降。也有研究显示[14],小鼠摄入复合微生物制剂后,其中所含有的乳酸杆菌、双歧杆菌等益生菌可通过抑制UC小鼠的β-葡萄糖醛酸酶、髓过氧化物酶的活性达到缓解结肠炎症状的目的,而KOGM在体外和体内均能促进乳酸杆菌和双歧杆菌等益生菌的大量繁殖[4,15-17],同时,KOGM(聚合度为5和10)经双歧杆菌和嗜酸乳杆菌分解所得到的产物具有较好的抗氧化能力,其主要是通过提高清除自由基的能力、减少脂类过氧化物的形成来实现抗氧化作用[7]。由此可见,KOGM具有改善UC症状的潜在功效,而国内外鲜有研究。

本实验结果显示,灌胃KOGM对TNBS诱导的小鼠溃疡性结肠炎有一定的改善作用,表现在KOGM能够使小鼠结肠的溃疡面积以及溃疡率明显降低,受损的结肠甚至可以恢复到接近正常状态,这与以上的研究结果相吻合。

综上所述,KOGM能够缓解由TNBS引起的小鼠溃疡性结肠炎,有望成为一种辅助治疗人溃疡性结肠炎的合生元,其作用机理可能与肠道菌群的平衡、Th1和Th2细胞因子的平衡等相关,还需进一步研究。

4 结论

本实验初步证实KOGM能够减轻小鼠UC症状,即稀便、懒动等,降低结肠的溃疡面积及溃疡率,使受损的结肠甚至恢复到接近正常状态,为KOGM缓解UC作用提供了一些理论依据,同时为研制UC药物指明了新方向。

[1]吴长菲,董岩岩,李俊俊,等. 魔芋葡甘露低聚糖的酶法制备工艺的初步研究[J]. 生物技术通报,2010(1):118-122.

[2]李涛,马美湖,邬应龙. 氧化—酸解法制备魔芋葡甘露低聚糖的初步研究[J]. 食品与发酵科技,2009,45(1):35-39.

[3]Pan T T,Peng S H,Xu Z L,etal. Synergetic degradation of konjac glucomannan by γ-ray irradiation and hydrogen peroxide[J]. Carbohydrate polymers,2013,93(2):761-767.

[4]Al-Ghazzewi F H,Khanna S,Tester R F,etal. The potential use of hydrolysed konjac glucomannan as a prebiotic[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2007,87(9):1758-1766.

[5]Suzuki H,Oomizu S,Yanase Y,etal. Hydrolysed konjac glucomannan suppresses IgE production in mice B cells[J]. International Archives of Allergy and Immunology,2010,152:122-130.

[6]Wu W T,Cheng H C,Chen H L. Ameliorative effects of konjac glucomannan on human faecal β-glucuronidase activity,secondary bile acid levels and faecal water toxicity towards Caco-2 cells[J]. British journal of nutrition,2011,105(4):593-600.

[7]Wang C H,Lai P,Chen M E,etal. Antioxidative capacity produced by Bifidobacterium-and Lactobacillus acidophilus-mediated fermentations of konjac glucomannan and glucomannan oligosaccharides[J]. Journal of the Science of Food and Agriculture,2008,88(7):1294-1300.

[8]Kawashima K,Nomura A,Makino T,etal. Pharmacological properties of traditional medicine(XXIX):effect of Hange-shashin-to and the combinations of its herbal constituents on rat experimental colitis[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin,2004,27(10):1599-1603.

[9]Carter M J,Lobo A J,Travis S P L. Guidelines for the management of inflammatory bowel disease in adults[J]. Gut,2004,53(suppl 5):v1-v16.

[10]徐阳,李伟光,刘海峰,等. 三硝基苯磺酸诱导小鼠溃疡性结肠炎模型制备的技术改良[J]. 世界华人消化杂志,2012,20(2):106-112.

[11]Uhlig H H,Coombes J,Mottet C,etal. Characterization of Foxp3+CD4+CD25+and IL-10-secreting CD4+CD25+T cells during cure of colitis[J]. The Journal of Immunology,2006,177(9):5852-5860.

[12]李小宁. 魔芋甘露低聚糖口服液对雌性 ICR 小鼠免疫功能的调节作用[J]. 江苏预防医学,1998,9(4):3-4.

[13]Zhao H M,Huang X Y,Zuo Z Q,etal. Probiotics increase T regulatory cells and reduce severity of experimental colitis in mice[J]. World Journal of Gastroenterology:WJG,2013,19(5):742.

[14]Jadhav S R,Shandilya U K,Kansal V K. Exploring the ameliorative potential of probiotic Dahi containing Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium bifidum on dextran sodium sulphate induced colitis in mice[J]. Journal of Dairy Research,2013,80(01):21-27.

[15]Connolly M L,Lovegrove J A,Tuohy K M. Konjac glucomannan hydrolysate beneficially modulates bacterial composition and activity within the faecal microbiota[J]. Journal of Functional Foods,2010,2(3):219-224.

[16]Elamir A A,Tester R F,Al-Ghazzewi F H,etal. Effects of konjac glucomannan hydrolysates on the gut microflora of mice[J].Nutrition & Food Science,2008,38(5):422-429.

[17]Dinoto A,Watumlawar C C,Yopi Y. In Vitro Modulation of Human Intestinal Microbiota by Mannoligosaccharides Synthesized from Amorphophallus muelleri Glucomannan[J]. Microbiology Indonesia,2014,7(4):144.

欧盟将实施食品安全标签新标准

从2014年12月13日起，欧盟开始实施欧洲议会在2011年通过的一项食品标签新标准，消费者将从标签上得到更多、更详细与食品相关的内容。

欧盟健康和食品安全委员会一位高级主管表示，食品标签新标准是多年努力的结果，消费者可以了解到更多与食品安全相关的信息。新标准要求食品标签必须清晰显著，准确地标注食品中所含可能导致过敏的成分，对大部分经过加工的食品标注营养成分，对网购和店购采取统一标准，标明解冻食品和替代品等。欧盟成员国的食品产业有3年过渡期，而且允许已经上市的食品和在2014年12月13日之前已贴好标签的食品一直卖完为止。

欧委会表示，会与食品生产和消费部门密切合作，以简明易懂的方式实施新的食品安全标签标准，并在2015年建成一个食品安全数据基地。

来源：慧聪食品工业网

Protective effect of konjac oligo-glucomannan on trinitrobenzene sulfonic acid-induced ulcerative colitis in mice

FENG Li,AN Xue-jiao,QI Yan,LIU Yu,ZHAO Fang-hui,ZHANG Bo*

(College of Arts and Science of Beijing Union University,Key Laboratory for Bioactive Substances and Functional Foods,Beijing 100191,China)

Objective:To investigate the protective effects of konjac oligo-glucomannan(KOGM)on the ulcerative colitis(UC)induced by trinitro benzene sulfonic acid(TNBS)in mice. Methods:Kunming mice were randomly divided into control group,model group,KOGM low dose group and high dose groups. The mixed solution including 100mg/kg bw TNBS and 50% ethanol was used for model building. After 24 hours,the high dose and low dose group were administrated with KOGM by gavage,and the volume was 10mL/kg bw. Results:There was no evident differences about average daily intake among groups,but compared with the model group,food efficiency ratio and body weight gain were significantly increased in both low dose and high dose groups. Compared with the model group,the ulcer areas and rates of the colon in low dose and high dose group were significantly decreased(p<0.01). The results of histopathological slice of colon showed that the damaged colon of high dose group were recovered better,even close to a normal state. Conclusion:KOGM had a protective effect for ulcerative colitis injury in mice,and the mechanism should be further explored.

Konjac mannan oligosaccharides;ulcerative colitis;mice;TNBS

2014-04-08

冯莉(1988-)，女，硕士研究生，研究方向:生物活性物质的功能与毒理。

*通讯作者:张波(1962-)，女，博士，教授，研究方向:生物活性物质的功能与毒理。

“十二五”国家科技支撑计划课题资助(2012BAD33B06)，北京联合大学“启明星”大学生科技创新项目(市级)资助。

TS201.4

A

1002-0306(2015)01-0349-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.065