响应面法优化微波法提取甘青青兰总黄酮工艺

杨娟霞,董 伟,韩林磊,夏从芳,高云涛,叶艳青

(云南民族大学化学与生物技术学院,民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室,云南昆明 650500)

响应面法优化微波法提取甘青青兰总黄酮工艺

杨娟霞,董 伟,韩林磊,夏从芳,高云涛,叶艳青*

(云南民族大学化学与生物技术学院,民族药资源化学国家民委-教育部重点实验室,云南昆明 650500)

目的:研究甘青青兰总黄酮的最佳提取工艺。方法:以甘青青兰为原料,比较振荡提取法、超声提取法以及微波提取法,得出微波法具有提取优势。在单因素的基础上,采用响应面法优化微波法提取总黄酮,分别选定微波时间、微波温度、乙醇浓度和液料比四个水平进行响应面实验,通过回归分析得到优化组合条件。结果:甘青青兰总黄酮微波提取最佳工艺条件为:微波时间7min,微波温度59℃,乙醇浓度27%,液料比25∶1mL/g,此条件下总黄酮实际得率为29.68%,与模型预测得率29.65%的相对误差为0.1%。结论:此优化方法可行,为甘青青兰总黄酮的提取提供了参考数据。

甘青青兰,总黄酮,响应面法,微波提取

唇形科青兰属的甘青青兰(HerbaDracocephaliTangutici)是多年生蔓生草本[1],又称唐古特青兰,藏药名知羊格[2],它分布于甘肃西南部、青海东部、四川西部和西藏东南部等地区,生于海拔1900～4600m的高山灌丛林地、松林边缘、砾石草坡、干燥河谷两岸,具有清热祛湿、疏风解表、舒肝和胃、清肝热胃热、止血、干黄水等功能[3],近来许多研究表明甘青青兰还具有抗缺氧、抗病毒、抑菌、止咳平喘等作用[4-7]。植物黄酮是一类低分子的天然活性成分,具有多种生物活性,如抗菌、抗氧化、镇定、利尿、抗肿瘤等[8]。研究表明,甘青青兰中含有多种黄酮类物质,如胡麻素、芹菜素、5,7,4′-三羟基-3′5′-二甲氧基黄酮,5,3′,4′-三羟基-6,7-二甲氧基黄酮等[9],其中已鉴定8个黄酮成分,分别是木犀草素和香叶木素的葡萄糖苷类[10]。植物化学成分分析显示,甘青青兰中黄酮类化合物含量高于其他多种传统中药[11]。

微波提取法应用于中药有效成分的提取,具有节能、省时、操作简便、得率高等优点,表现出良好的发展前景和巨大的应用潜力[12]。响应面法(RSM)以最经济的方式,较少的实验次数和较短的时间对所选的实验参数进行全面研究,越来越多地应用于各种生物化工处理过程[13]。目前对于甘青青兰中总黄酮提取工艺的研究未见报道,为了探究甘青青兰中总黄酮提取的最佳工艺条件,本文以甘青青兰中的总黄酮为研究对象,对提取方法进行了比较,结果显示,微波提取法更有优势。选定微波时间、微波温度、乙醇浓度和液料比四个因素进行单因素实验,在此基础上,应用响应面法对甘青青兰总黄酮的提取条件进行优化,利用回归分析得到总黄酮的最优提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甘青青兰 购于迪庆藏族自治州藏医院;芦丁标准品 中国药品生物制品检定所生产 含量为98%;无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠 均为分析纯;实验用水 均为超纯水。

WFZUV-2000型紫外分光光度计 上海尤尼柯仪器有限公司;EXCEL微波快速消解仪 上海屹尧仪器科技发展有限公司;AR224CN型电子天平 上海奥豪斯仪器有限公司;101-型电热鼓风干燥箱 上海仪器厂有限公司;WL-200高速中药粉碎机 瑞安市威力制药机械厂;EPED-20TH实验超纯水器 南京易普易达科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 黄酮的测定方法 采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH法测定总黄酮。取适量样品液于25mL的容量瓶中,加30%乙醇10.00mL及5%的NaNO2溶液1.00mL摇匀,静置6min,加10%的Al(NO3)3溶液1.00mL摇匀,静置6min,加1mol/L的NaOH溶液10.00mL摇匀,加超纯水稀释至刻度,摇匀,静置15min,以试剂为空白,在498nm处测定其吸光度值。

总黄酮得率(%)=提取液中总黄酮质量/物料质量×100

1.2.2 标准曲线绘制 准确称取120℃干燥至恒重的芦丁标准品0.05g(精确至0.0001g)溶解于60%乙醇中并定容至50mL,40℃水浴溶解,摇匀,制成1.0mg/mL的标准品溶液。分别取0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60mL标准品溶液于9个25mL容量瓶中,用“1.2.1”的方法测得其吸光度,以样品浓度为横坐标,吸光度值为纵坐标,绘制标准曲线。得到的标准曲线方程为:A=0.0125C+0.005,R2=0.9999。

1.2.3 微波法提取总黄酮[14]准确称取0.2g(精确至0.0001g)甘青青兰于消解罐中,加入适量的一定浓度的乙醇后置于微波中按不同的条件萃取。再抽滤,定容为50mL。取1mL的样品液于25mL的容量瓶中,用“1.2.1”的方法测得其吸光度。

1.2.4 振荡法提取总黄酮[15]准确称取0.2g(精确至0.0001g)甘青青兰于试管中,按料液比1∶20加入30%乙醇,振荡2h。再抽滤,定容为50mL。取1mL的样品液于25mL的容量瓶中,用“1.2.1”的方法测得其吸光度。

1.2.5 超声法提取总黄酮[16]准确称取0.2g(精确至0.0001g)甘青青兰于小烧杯中,按料液比1∶20加入30%乙醇,用保鲜膜封住烧杯口,超声1h。再抽滤,定容为50mL。取1mL的样品液于25mL的容量瓶中,用“1.2.1”的方法测得其吸光度。

1.2.6 单因素实验的设置 选定微波温度为60℃,乙醇浓度为60%,液料比为20∶1,考察微波时间对总黄酮得率的影响。选定微波时间为5min,乙醇浓度为30%,液料比为20∶1,考察微波温度对总黄酮得率的影响。选定微波时间为5min,温度为60℃,液料比20∶1,考察乙醇浓度对总黄酮得率的影响。选定微波时间为5min,温度为60℃,乙醇浓度为60%,考察液料比对总黄酮得率的影响。

1.2.7 响应面法优化微波法提取甘青青兰总黄酮工艺处理 选取微波时间、微波温度、乙醇浓度和液料比作为响应面设计的4个因素,分别以X1、X2、X3和X4表示。在单因素实验的基础上,运用响应面分析法,对甘青青兰总黄酮的提取过程进行优化,选择最佳提取条件。

我守着毛毛的新坟，在山顶歇了四夜夕。我实在是太累了，头也疼得很。渴了就下山到河边喝点儿，饿了就啃两口讨来的米粑。那米粑被水泡过再晒干，硬得像铁似的，我还是当个宝样儿，生怕撒落了一星半点。夜深人静的时候，有么事风吹草动我一点儿也不怕，反倒热切地盼望有鬼就出来吧，你既然是灵是仙，那你告诉我，我的狼剩儿如今是在哪一方天？你告诉我，我的毛毛他转世投生，是去了个好人家吗？

表1 响应面实验因素水平编码表Table 1 Factor and levels of response surface experiments

1.3 数据统计分析

实验所得数据采用Design Expert 8.05b软件为辅助手段设计响应面实验,选用Box-Behnken Design模型(BBD)进行回归分析。通过对回归模型方差及回归模型各项方差的分析,检验回归模型拟合度及其显著性。根据回归分析结果,做出响应面曲面图,分析各实验因素对微波提取甘青青兰中总黄酮效果的影响。

2 结果与分析

2.1 总黄酮提取方法考察结果比较

振荡提取、超声提取和微波提取的得率分别为:25.40%、25.82%和29.34%,结果显示,微波提取法效率最高,因此,选定微波提取法为样品的提取方法。

2.2 单因素实验结果与分析

2.2.1 微波时间对甘青青兰总黄酮得率的影响 由图1可知,当微波时间低于5min时,随着微波时间的延长,总黄酮得率升高。当微波时间大于5min时,总黄酮得率随时间的延长反而呈下降趋势,这可能是由于微波时间过长导致黄酮破坏和分解的原因。因此选择微波时间为5min。

图1 微波时间对总黄酮得率的影响Fig.1 Effect of microwave time on extraction yield of total flavonoids

2.2.2 微波温度对甘青青兰总黄酮提取率的影响 由图2可知,总黄酮得率随着微波温度的增加而增加,当温度高于60℃时,黄酮含量反而呈下降的趋势,这可能是由于提取温度升高,杂质溶出物增多,吸附了黄酮的原因。因此选择微波温度为60℃。

图2 微波温度对总黄酮得率的影响Fig.2 Effect of microwave temperature on extraction yield of total flavonoids

2.2.3 乙醇浓度对甘青青兰总黄酮得率的影响 由图3可知，总黄酮提取率随乙醇浓度的增加而增加。当乙醇浓度大于30%时，总黄酮含量不再随微波温度增加而增加。原因可能是乙醇浓度不同，极性不同，对杂质溶出量和总黄酮提取量影响的原因，因此选择乙醇浓度为30%。

图3 乙醇浓度对总黄酮得率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids

图4 液料比对总黄酮得率的影响Fig.4 Effect of liquid/material ratio on extraction yield of total flavonoids

2.3 响应面法提取条件的优化

在单因素实验基础上,使用Design Expert 8.05b软件,设计了四因素三水平的响应面分析实验,其方案与实验结果见表2。响应面优化回归方程的方差分析见表3。

表2 Box-Benhken中心组合设计方案及实验结果Table 2 Results of response surface experiments

各因素经回归拟合后得到回归方程:Y1(%)=29.40+0.058X1+0.072X2+0.21X3+0.45X4+0.13X1X2-0.070X1X3+0.21X1X4+0.37X2X3-0.19X2X4-0.48X3X4-0.17X12-0.38X22-0.74X32-0.35X42。

由表3可知,所建立的回归模型p<0.0001,达到极显著水平,失拟项(p=0.1254)不显著,并且决定系数R2=0.9434,说明回归模型和预测值之间有较好的拟合度,自变量与响应值之间线性关系显著,因此该模型可用于预测总黄酮得率Y的实际情况。

表3 响应面优化回归方程的方差分析Table 3 Analysis of variance of optimal regression equation by response surface methodology

由表4可知,模型一次项X3和X4极显著;交互项X2X3和X3X4极显著;二次项X22、X32和X42极显著,X12显著。由此可知,自变量与响应值之间不是简单的线性关系。从F值大小可以看出,各因素对总黄酮得率的影响程度依次是X4>X3>X2>X1,即液料比>乙醇浓度>微波温度>微波时间。

表4 响应面分析优化后模型的系数检验Table 4 Coefficient test of optimal mode by response surface methodology

注:**表示极显著(p<0.01),*表示显著(0.01

根据回归分析结果,做出响应面曲面图5～图7,由图5可知,随着液料比的增大总黄酮得率有明显的变化趋势,而随着微波时间的延长总黄酮得率变化不太明显,由等高线可看出,沿液料比向峰值移动,等高线密度高于沿微波时间移动的密度,表明微波时间对响应面贡献更大。同理,得出单因素对总黄酮得率的影响程度依次是液料比(X4)>乙醇浓度(X3)>微波温度(X2)>微波时间(X1),与F值大小比较得出的结果相符,由图6和图7可知X2X3和X3X4交互影响极显著,结论进一步得到验证。

图5 液料比与微波时间 对总黄酮得率影响的响应面曲面图Fig.5 Response surface plot showing the interactive effects of liquid/material ratio and microwave time on extraction yield of total flavonoids

图6 乙醇浓度与微波温度 对总黄酮得率影响的响应面曲面图Fig.6 Response surface plot showing the interactive effects of ethanol concentration and microwave temperature on extraction yield of total flavonoids

图7 乙醇浓度与液料比 对总黄酮得率影响的响应面曲面图Fig.7 Response surface plot showing the interactive effects of ethanol concentration and liquid/material ratio on extraction yield of total flavonoids

根据得到的模型,使用点预测得到其最优工艺条件是微波时间7min,微波温度58.97℃,乙醇浓度27.39%,液料比25∶1,在此条件下总黄酮得率理论值为29.65%。检测实际结果与预测值是否相一致,考虑到实际操作的便利,将最佳工艺条件修正为微波时间7min,微波温度59℃,乙醇浓度27%,液料比25∶1,在此条件下实际总黄酮得率平均值为29.68%,与模型预测得率29.65%的相对误差为0.1%,即该模型可靠。

3 结论

本文的研究表明,相对另外两种常用提取方法,微波法对甘青青兰中总黄酮的提取更有优势。通过响应面实验设计,获得最佳提取工艺条件为:微波时间7min,微波温度59℃,乙醇浓度27%,液料比25∶1。该研究过程有效提高甘青青兰中总黄酮的得率。由响应面实验得到的模型可靠,说明该方法可行,可以预测各因素对得率的影响,为今后甘青青兰中总黄酮的提取研究提供了一定的参考数据。

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Optimization of microwave extraction of flavones inHerbaDracocephaliTanguticiusing the response surface method

YANG Juan-xia,DONG Wei,HAN Lin-lei,XIA Cong-fang,GAO Yun-tao,YE Yan-qing*

(Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources,State Ethnic Affairs Commission & Ministry of Education,School of Chemistry and Biotechnology,Yunnan University of Nationalities,Kunming 650500,China)

Objective:To investigate the optimal extraction conditions of flavones fromHerbaDracocephaliTangutici. Methods:HerbaDracocephaliTanguticias the raw material. Flavones were extracted by different ways such as Oscillatio,ultrasonic and microwave,and the extraction effects were compared. The results indicated that microwave extraction had the advantage of higher efficiency. Four extraction parameters including microwave time,microwave temperature,ethanol concentration and liquid/material ratio were optimized using response surface methodology based on single factor experiments for achieving maximum flavones extraction rate. Results:Results showed that these optimal extraction conditions were as follows:microwave time of 7min,microwave temperature of 59℃,ethanol concentration of 27%,and liquid/material ratio of 25∶1mL/g. Under those conditions the actual yield rate of flavones was 29.68%,and the relative error between the predicted yield 29.65% was 0.1%. Conclusion:The results demonstrated that this method was feasible,and provided reference data for the extraction of flavones fromHerbaDracocephaliTangutici.

HerbaDracocephaliTangutici;flavones;response surface method;microwave extraction

2014-04-16

杨娟霞(1990-)，女，硕士，研究方向：分离分析科学。

*通讯作者:叶艳青(1967-)，女，硕士，教授，研究方向：分离分析和现代仪器分析化学。

国家自然科学基金项目(51062018)；国家民委科研项目(12YNZ006)；云南民族大学绿色化学与功能材料研究省创新团队(2011HC008)；云南省高校绿色化学新能源与材料科技创新团队(2011UY09)；云南民族大学化学与生物技术学院研究生创新项目(11HXYJSZ4)和本科创新项目(2011HX15)；云南民族大学化学与生物技术学院2013年大学生(硕士组)SRT创新性实验项目(2013HXSRTY04)。

TS201.1

B

1002-0306(2015)01-0216-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.036