芽孢杆菌配伍发酵菜籽粕产中性蛋白酶条件研究

温拥军,游玟娟,郭 浪

(湖南化工职业技术学院,湖南株洲 412004)

芽孢杆菌配伍发酵菜籽粕产中性蛋白酶条件研究

温拥军,游玟娟,郭 浪

(湖南化工职业技术学院,湖南株洲 412004)

为了提高中性蛋白酶的产量,采用响应曲面法研究了微生物配伍发酵菜籽粕产中性蛋白酶的条件。确定了微生物配伍菌种为BacillussubtilisUV-7+UN-11(1∶1);在单因素实验基础上,以中性蛋白酶活力为指标,进行Box-Behnken设计,获得最佳发酵条件为:发酵温度35.7℃,转速193r/min,接种量为7.58%,该条件下中性蛋白酶活力的理论值为2709.9U/mL,在最佳条件下进行3次验证,中性蛋白酶活力为(2714.5±2.4)U/mL,与理论预测值基本一致,比未优化前的2602.7U/mL提高了4.3%。

芽孢杆菌,菌株配伍,菜籽粕,中性蛋白酶,发酵条件

中性蛋白酶是一类能在中性pH条件下,将蛋白质水解成肽类和部分游离氨基酸的内肽酶。它在食品工业、皮革工业、医药工业及化妆品行业等方面有广泛的应用[1-6]。菜籽粕是油菜籽经预压浸出工艺处理后得到的副产物,其含蛋白质、粗纤维较丰富。常用来做饲料蛋白、有机肥料、提取植酸、单宁等化工原料,还可用作食品添加剂[7-11]。但以菜籽粕为原料,通过微生物发酵生产酶制剂少见报道。本实验利用芽孢杆菌配伍发酵菜籽粕生产中性蛋白酶,并采用响应曲面法优化发酵条件,旨在提高酶产量,进一步降低生产成本。利用菜籽粕发酵生产中性蛋白酶,对扩大菜籽粕的应用范围,提高菜籽粕的附加值,促进其综合利用有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis) 购于中国微生物菌种保藏中心;枯草芽孢杆菌BacillussubtilisUV-7、UN-11,本实验组诱变所得中性蛋白酶高产突变株;斜面培养基:牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,NaCl 0.5%,琼脂2%;液体种子培养基:牛肉膏0.3%,蛋白胨1%,NaCl 0.5%;液体发酵培养基:菜籽粕 5%,Na2HPO4·12H2O 0.04%,KH2PO40.03%,CaCl20.1%,调至pH7.0。

超净工作台CBV-1500A 上海瑞仰净化装备有限公司;恒温培养摇床QYC.2102 上海福玛实验设备有限公司;生化培养箱HPS-250 哈尔滨东明医疗仪器厂;紫外可见分光光度计UV-9100 北京瑞利分析仪器公司;离心机LDZ4-0.8A 北京医用离心机厂;水浴锅HH.SYH-Ni2-C 北京长源实验设备厂。

1.2 实验方法

表2 不同菌株配伍发酵中性蛋白酶活Table 2 Protease activity of products fermented by different strains and their combination

注:BL为Bacilluslicheniformis的简称。

1.2.1 菜籽粕脱毒处理 采用纯碱脱毒法[12],向菜籽粕中加入10%的纯碱溶液,加压蒸沸15min,去除硫甙等有毒物质。

1.2.2 配伍菌种的选择 将供试的三种菌株制成摇瓶种子液,两两配伍或三者配伍(比例均为1∶1)按6%总接种量接入装有100mL液体发酵培养基的250mL摇瓶中,置于温度为37℃、转速为200r/min摇床上发酵培养48h时,测定中性蛋白酶活力。

1.2.3 粗酶液制备 取一定量的发酵液,置于4000r/min的离心机上离心分离15min,取上清液经8层纱布过滤所得澄清液体即为粗酶液。

1.2.4 酶活力测定 按蛋白酶活力测定法GB/T23527-2009进行[13]。酶活力单位定义:在pH7.0、40℃条件下,每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量为1个蛋白酶活力单位(U)。

1.2.5 单因素实验设计 分别以发酵温度、发酵时间、转速、接种量、装液量为单因素进行实验,探讨各因素对中性蛋白酶活的影响。

取6个250mL摇瓶,装入100mL液体发酵培养基后,按6%的总接种量(UV-7、UN-11 各3%)接入种子液,分别置于温度分别为30、32、34、36、38、40℃,转速200r/min的摇床发酵培养48h。

取5个250mL摇瓶,装入100mL液体发酵培养基后,按6%的总接种量(UV-7、UN-11 各3%)接入种子液,置于温度为36℃,转速为200r/min的摇床发酵培养分别发酵36、42、48、54、60h。

取5个250mL摇瓶,装入100mL液体发酵培养基后,按6%的总接种量(UV-7、UN-11 各3%)接入种子液,分别置于转速为140、170、200、230、260r/min,温度为36℃的摇床发酵培养分别发酵48h。

取5个250mL摇瓶,装入100mL液体发酵培养基后,分别接入2%、4%、6%、8%、10%的种子液,于温度为36℃、转速为200r/min的摇床发酵培养分别发酵48h。

取5个250mL摇瓶,分别装入将60、80、100、120、140mL的液体发酵培养基,按6%的总接种量(UV-7、UN-11 各3%)接入种子液,置于转速为200r/min,温度为36℃的摇床发酵培养分别发酵48h。

1.2.6 响应面分析 在单因素实验基础上,按Box-Behnken实验设计原理,选取温度、转速、接种量进行三因素三水平中心组合实验,见表1。利用mintab15软件进行分析,确定最佳发酵条件。

2 结果与分析

2.1 不同菌株配伍发酵结果

按实验方法,将三种供试菌种按1∶1比例配伍发酵48h测定中性蛋酶活力,得到结果如表2所示。

从表2结果可知,单菌株产中性蛋白酶活力:UN-11>UV-7>BL,在配伍组合中,UV-7+UN-11中性蛋白酶活力最高,达到2602.7U/mL,该两菌株表现出良好的协同性。而BL菌株无论是与UV-7、UN-11两两配伍,还是BL+UV-7+UN-11三者配伍,中性蛋白酶活力均大大降低,表现出该菌株与UV-7和UN-11之间存在一定的拮抗性,因此,最佳配伍组合菌株为UV-7+UN-11。

表1 BBD实验设计因素水平编码表Table 1 Factor and levels table of BBD design

2.2 单因素实验结果与分析

2.2.1 发酵温度对中性蛋白酶活力的影响 温度能对细胞内生化反应速度产生作用,对细胞的生长和代谢产物的积累产生影响,温度过高或过低对发酵产物的积累都是不利的。一般来讲,微生物在一定条件下发酵,均存在一个最利于发酵产物积累的温度,即最适发酵温度。从图1结果来看,发酵温度对中性蛋白酶活力存在显著影响。当发酵温度逐渐增加时,中性蛋白酶活力大小呈“钟罩”状,最适发酵温度为36℃,该温度下中性蛋白酶活力为2635.4U/mL。

图1 发酵温度对中性蛋白酶活力的影响Fig.1 Effect of temperature on neutral protease activity

2.2.2 发酵时间对中性蛋白酶活力的影响 由图2可知,发酵时间在30～54h内,中性蛋白酶活力随时间的增加而增大,但超过48h后,增速缓慢;而当发酵时间超过54h后,中性蛋白酶活力反而下降。原因是中性蛋白酶的积累与芽孢杆菌的生长不一致,有一定的“滞后性”。从效益角度来看,发酵时间选48h为佳。

图2 发酵时间对中性蛋白酶活力的影响Fig.2 Effect of time on neutral protease activity

2.2.3 转速对中性蛋白酶活力的影响 因为芽孢杆菌是好氧微生物,溶氧是其液体发酵主要限制因素。一定的摇床转速能促进气液间传质,提高溶氧浓度有利于发酵,提高产量。但转速过快,会产生过大的剪切力,损伤细胞而导致产量下降。由图3可以看出,转速对中性蛋白酶活力影响显著。当转速200r/min时,中性蛋白酶活力最高,为2660.2U/mL,再降低或升高转速,中性蛋白酶活力均明显下降,故转速宜选200r/min。

图3 转速对中性蛋白酶活力的影响Fig. 3 Effect of revolution on neutral protease activity

2.2.4 接种量对中性蛋白酶活力的影响 从图4可知,接种量对中性蛋白酶活力影响较为显著,且呈正相关。接种量为6%,中性蛋白酶活力为2670.6U/mL。但当接种量>6%后,酶活的增速减缓。适当增加接种量,能节约生产时间,但接种量太大则会增加制备种子液的成本,因此接种量宜选6%。

图4 接种量对中性蛋白酶活力的影响Fig.4 Effect of inoculum concentration on neutral protease activity

2.2.5 装液量对中性蛋白酶活力的影响 在摇瓶发酵实验中,装液量对发酵的溶氧量影响极大,装液量少则溶氧高,反之则反。由表3可知,装液量越少溶氧越高,单位体积中性蛋白酶活力越高,总酶活则100mL装液量时最高,达到2.70×105U。故装液量宜选100mL。

表3 装液量对中性蛋白酶活力的影响Table 3 Effect of medium volume on neutral protease activity

2.3 响应面实验结果与分析

选取对影响中性蛋白酶活力较显著的3个因素作为考察对象,即温度(X1)、转速(X2)、接种量(X3)。其它因素选最佳水平。按Box-Behnken设计,进行3因素3个水平实验。BBD实验结果见表4。实验设计及数据分析均采用Minitab15软件。

表4 Box-Behnken设计及实验结果Table 4 Box-Behnken design and experimental results

利用 Minitab15软件对表4 数据进行二次多元回归拟合,得到二次多项回归模型:中性蛋白酶活力 Y=2715.4-8.6X2-12.4X3-61.7X12-22.3X22+36X1X2-24X1X3-24.8X2X3。模型的方差分析表明(见表5),模型回归的p=0.000,失拟项的p=0.136>0.1,说明模型失拟不显著,回归显著。转速(X2)、接种量(X3)以及X1、X2平方项和交互项对中性蛋白酶活力影响显著,而温度(X1)与X3平方项不显著。R2(调整)=96.55%,表明该模型能够解释96.55%酶活随发酵条件的变化,可用该模型预测发酵中中性蛋白酶活力的理论值。对模型求解,得到最佳条件为:X1=-0.15、X2=-0.35、X3=1.58,换算成实际水平,即:发酵温度35.7℃,转速193r/min,接种量为7.58%,该条件下中性蛋白酶活力的理论值为2709.9U/mL,在最佳条件下进行3次验证,所得结果平均值为(2714.5±2.4)U/mL,与理论预测值基本一致,说明模型对实际生产有一定指导作用。

表5 模型的方差分析Table 5 Variance analysis of model

采用Mintab15软件绘制三维响应面图和等高线图,可直观地看出最佳参数及各参数间的交互作用,如图5～图7。当特征值均为正值时,响应面分析图为山谷形曲面,有极小值存在。当特征值为负值时,为山丘曲面,有极大值存在。当特征值有正有负时,为马鞍形曲面,无极值存在[14-15]。等高线的形状可反映出交互作用的强弱,椭圆形表示两因素交互作用显著,而圆形则表示不显著。从图5可以看出,当接种量固定在X3=0时,等高线呈椭圆形,说明温度与转速之间的交互作用十分显著,当温度为35.8℃时,转速在180～196r/min范围内,中性蛋白酶活力随转速增加而增加,当转速>196r/min 后,则随转速增加酶活反而下降,当转速为196r/min时,存在最大酶活2716.6U/mL。从图6、图7可以看出,响应曲面呈马鞍状,没有最大值和最小值,且发酵温度与接种量、接种量与转速之间交互作用都极为显著,对中性蛋白酶活力的影响较复杂。

图5 Y=f(X1,X2)响应面立体分析和等高线图Fig.5 Response surface and contour plots of y=f(X1,X2)

图6 Y=f(X1,X3)响应面立体分析和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots of y=f(X1,X3)

图7 Y=f(X2,X3)响应面立体分析和等高线图Fig.7 Response surface and contour plots of y=f(X2,X3)

3 结论

本实验采用响应曲面法研究了微生物配伍发酵菜籽粕产中性蛋白酶的条件。确定了微生物配伍菌种BacillussubtilisUV-7+UN-11(1∶1);通过单因素实验确定了各显著因素及水平,分别为:温度36℃,转速200r/min,接种量6%。在此基础上运用Box-Behnken设计,进行三因素三水平实验,采用Minitab15软件对实验结果进行多元回归拟合,得到二次多项回归方程:中性蛋白酶活力 Y=2715.4-8.6X2-12.4X3-61.7X12-22.3X22+36X1X2-24X1X3-24.8 X2X3。得到最佳条件为:发酵温度35.7℃,转速193r/min,接种量为7.58%,该条件下中性蛋白酶活力的理论值为2709.9U/mL,在最佳条件下进行3次验证,所得结果平均值为(2714.5±2.4)U/mL,与理论预测值基本一致,比未优化前的2602.7U/mL提高了4.3%,说明模型对实际生产有一定指导作用。

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Fermentation conditions of neutral protease on rapeseed meal fromBacilluscompatibility

WEN Yong-jun,YOU Wen-juan,GUO Lang

(Hunan Chemical Industry Vocational Technology Institute,Zhuzhou 412004,China)

In order to increase the yield of neutral protease,the fermentation conditions of strain compatibility based on rapeseed meal were optimized by single factor tests and Response Surface Methodology(RSM). The results showed that the best strain compatibility wasBacillussubtilisUV-7 and UN-11(1∶1). The second-order polynomial model for neutral protease was established,and the optimal fermentation technology was obtained as following:temperature 35.7℃,rotational speed 193r/min,and inoculum concentration 7.58%.Under the optimal conditions,the predicted yield of fitted model was 2709.9U/mL and verification test result was 2714.5±2.4U/mL,which increased 4.3% compared with the original conditions.

Bacillus;strain compatibility;rapeseed meal;neutral protease;fermentation conditions

2014-05-04

温拥军(1980- )，男，硕士，副教授，研究方向：微生物发酵工程。

湖南化工职业技术学院重点课题(Hnhy2012A003)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)01-0166-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.026