溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜SOCS2、SOCS3的表达及意义＊

周婷婷， 仝巧云， 袁晋华

宜昌市中心人民医院消化内科，三峡大学消化疾病研究所，宜昌443000

溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜SOCS2、SOCS3的表达及意义＊

周婷婷， 仝巧云△， 袁晋华

宜昌市中心人民医院消化内科，三峡大学消化疾病研究所，宜昌443000

目的 研究溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜细胞因子信号转导抑制子SOCS2、SOCS3的表达，探讨其与溃疡性结肠炎的关系。方法 将30只雄性SD大鼠随机均分为正常对照组、结肠炎模型组和柳氮磺胺吡啶（SASP）组，采用三硝基苯磺酸（TNBS）诱导制备溃疡性结肠炎大鼠模型。观察大鼠一般情况并评价疾病活动指数（DAI），造模7d后处死大鼠，评价其组织学损伤指数（CMDI）及肠黏膜损伤指数（TDI）；采用免疫比浊法检测血清C-反应蛋白（CRP）浓度；采用RT-PCR及Western blot检测结肠组织IL-6mRNA、SOCS2、SOCS3mRNA及蛋白的表达。结果 结肠炎模型组DAI、CMDI、TDI评分及CRP水平显著高于正常对照组，SASP组显著低于模型组，差异均有统计学意义（均P＜0.01）；结肠炎模型组IL-6mRNA、SOCS2和SOCS3mRNA及蛋白表达高于正常对照组（均P＜0.05），SASP组IL-6mRNA、SOCS2、SOCS3mRNA及蛋白表达低于模型组（均P＜0.05）。结论 溃疡性结肠炎中SOCS2、SOCS3的表达与疾病严重程度相关，随着炎症程度的加重，SOCS2、SOCS3的表达水平上调。

溃疡性结肠炎； 三硝基苯磺酸； 柳氮磺胺吡啶； 细胞因子信号转导抑制子

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种病因不明的肠道慢性炎症、溃疡性疾病，近年来发病率呈逐年上升趋势，但其发病机制仍不完全明确，多被认为是一种自身免疫性疾病。细胞因子被认为是参与UC发病的重要因素之一，JAK-STAT信号途径是多种细胞因子共同的信号转导途径［1］，研究发现细胞因子信号抑制子（suppressors of cytokine sig－naling，SOCS）家族是JAK／STAT信号途径的重要负调控因子［2］，但其在UC的表达情况及其与炎症因子的相关性研究鲜有报道，因此，研究SOCS2／3在UC肠黏膜局部的表达情况及其与肠黏膜炎症关系，有助于进一步了解UC的发病机制并为研发新的治疗药物提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物和材料

SPF级雄性SD大鼠30只，体重（200±20）g，购于三峡大学动物中心［SCXK（鄂）2011-0012］，并在该实验中心分笼饲养［SYXK（鄂）2011-0061］。主要试剂:三硝基苯磺酸（2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid，TNBS）购自美国Sigma公司，柳氮磺胺吡啶（SASP）购自上海信谊嘉华药业公司，引物由上海生物工程公司合成，抗体购自Santa Cruz生物试剂公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组及模型建立 将大鼠随机均分为正常对照组、模型组、SASP组。模型组、SASP组大鼠参照文献［3］制备大鼠溃疡性结肠炎模型:禁食24h，棉签刺激大鼠肛周诱导排便，10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3mL／kg），石蜡油润滑大鼠灌胃针，插入肠道内约8cm，一次性结肠灌注100mg／kg TNBS（与无水乙醇溶液等体积混合），提起尾部倒立3min后，回笼常规饲养；正常对照组予相同剂量的0.9%氯化钠溶液灌肠。造模第2天起SASP组大鼠予200mg／kg［4］的SASP溶液灌胃，正常对照组、模型组予等体积的0.9%氯化钠溶液灌胃。给药7d后处死大鼠，采集标本。

1.2.2 症状、体征观察及评分 观察大鼠一般情况。参照文献［5］进行疾病活动指数（disease activity index，DAI）评分评估大鼠一般情况。

1.2.3 结肠黏膜大体形态损伤评分 处死大鼠，取出结肠，沿肠系膜缘剖开，冰生理盐水漂洗，肉眼观察结肠大体损伤情况。参照文献［6］进行结肠大体形态损伤评分（colon mucosal damage index，CMDI）。

1.2.4 结肠组织病理学检查 取大鼠结肠组织，制备石蜡切片，苏木精-伊红（HE）染色，观察肠黏膜损伤情况，参照文献［6］进行结肠组织学损伤指数（tissues damage index，TDI）评分评估结肠黏膜组织学损伤情况。

1.2.5 免疫比浊法检测血清C-反应蛋白浓度 取血清，采用免疫透射比浊法经生化分析仪测定各组大鼠血清C-反应蛋白（CRP）浓度。

1.2.6 RT-PCR检测结肠组织IL-6mRNA表达水平 称取结肠组织100mg，提取总RNA，逆转录并PCR扩增，产物凝胶电泳，凝胶成像系统成像，灰度分析。引物序列:IL-6，上游引物5′-GACTGATGTTGTTGACAGCCACTGC-3′，下游引物5′-AGCCACTCCTTCTGTGACTCTAACT-3′（508bp）；GAPDH，上游引物5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′，下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′（480bp）。RT-PCR反应条件:Mix 5.5μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板1.0μL，加超纯水至25μL。反应条件为:94℃5min，94℃30s，53℃30s，72℃30s，共30个循环；最后72℃5min。

1.2.7 RT-PCR检测结肠组织SOCS2／3mRNA表达水平 称取结肠组织100mg，提取总RNA，逆转录并PCR扩增，产物凝胶电泳，凝胶成像系统成像，灰度分析。引物序列:SOCS2:上游引物5′-AAGACATCAGCCGGGCCGAC-3′，下游引物5′-TCTTGTTGGTAAAGGTAGTCCC-3′，300bp；SOCS3:上游引物5′-ATGGTCACCCACAGCAAGTTTC-3′，下游引物5′-CGCCCCCAGAATAGATGTAGTAG-3′，514bp。RT-PCR反应条件:Mix 5.5μL，上下游引物各0.5μL，cDNA模板1.0μL，加超纯水至25μL。反应条件为:94℃5min，94℃30s，54℃30 s，72℃30s，共30个循环；最后72℃5min。

1.2.8 Western blot检测结肠组织SOCS2／3蛋白表达水平 称取组织约100mg剪碎，加细胞裂解液（含PMSF）1mL于冰上反复研磨，吸取匀浆液，4℃离心12 000r／min×5min，取上清制样。BCA法测定总蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳将蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉液封闭2h，一抗4℃静止过夜，洗涤10min×3，加二抗，室温摇床孵育50min，洗涤10min×3，ECL化学发光显影，灰度分析。

1.3 统计学处理

采用SPSS13.0统计软件，计量资料以¯x±s表示，组间均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

正常对照组大鼠活动正常，反应机敏，体毛光泽，大鼠体重增加，粪便成形。大鼠造模第2天出现不同程度的精神萎靡、懒动、厌食表现，体毛失去光泽且杂乱，活动和进食明显减少，并出现不同程度的血便、黏液便，体重下降，实验过程中死亡2只。SASP干预后大鼠一般情况好转，大便逐渐恢复成形，未观察到明显黏液脓血便。对各组进行症状及体征评分，结果见表1。

2.2 结肠大体形态损伤评分

正常对照组大鼠结肠未见充血、水肿、扩张，黏膜未见充血、糜烂及溃疡。模型组大鼠可见部分肠管扩张，肠壁水肿，皱褶消失，肠黏膜充血、溃疡及污秽苔附着。SASP组大鼠结肠病变明显减轻，无明显水肿扩张，肠黏膜局部可见充血水肿，未见明显糜烂、溃疡。模型组大鼠结肠大体形态评分显著高于正常对照组（P＜0.01），SASP组较模型组显著下降（P＜0.01）（表1）。

2.3 结肠组织病理学评分

镜下观察正常对照组大鼠结肠组织形态正常，结构清晰，黏膜无坏死脱落，未见明显炎性细胞浸润。模型组大鼠结肠组织可见黏膜水肿，部分肠黏膜坏死脱落，杯状细胞减少，大量炎性细胞浸润，腺体结构紊乱，可见隐窝脓肿形成。SASP组大鼠结肠组织病变明显减轻，溃疡愈合，隐窝脓肿消失，炎性细胞浸润明显减少。模型组大鼠结肠组织病理学评分显著高于正常对照组（P＜0.01），SASP组较模型组显著下降（P＜0.01），差异有统计学意义（图1，表1）。

表1 各组大鼠DAI、CMDI、TDI评分（¯x±s）Table1 Scoring for DAI，CMDI and TDI in rats in each group（¯x±s）

图1 各组大鼠结肠组织病理切片（苏木精-伊红染色，×100）Fig.1 Histopathological changes of colon tissues of rats in each group（HE staining，×100）

2.4 血清CRP浓度测定

与正常对照组相比，结肠炎模型组的大鼠血清CRP的水平显著增高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比，SASP组大鼠血清CRP水平显著下降，差异具有统计学意义（P＜0.01），见表2。

表2 各组大鼠血清CRP浓度（¯x±s，mg／L）Table2 Serum CRP levels in rats in each group（¯x±s，mg／L）

2.5 结肠组织IL-6 mRNA表达水平

模型组大鼠结肠组织IL-6mRNA表达高于正常对照组（P＜0.01），与模型组比较，SASP组IL-6 mRNA表达明显下降（P＜0.05），见图2、表3。

2.6 结肠组织SOCS2、SOCS3表达

模型组大鼠结肠组织SOCS2、SOCS3mRNA和蛋白表达水平高于正常对照组，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。与模型组比较，SASP组大鼠结肠组织SOCS2、SOCS3mRNA和蛋白表达水平下降（P＜0.01，P＜0.05），见图2、表3。

图2 各组大鼠结肠组织IL－6mRNA、SOCS2／3mRNA及蛋白表达Fig.2 Expressions of IL-6mRNA and SOCS2／3mRNA and protein in colonic tissues of rats in each group

表3 各组大鼠IL-6mRNA、SOCS2／3mRNA和蛋白表达水平（¯x±s）Table3 Expression levels of IL－6mRNA and SOCS2／3mRNA and protein in colonic tissue of rats in each group（¯x±s）

3 讨论

本实验采用TNBS诱导大鼠溃疡性结肠炎模型模拟UC的发病，结果显示，模型组中结肠组织炎症损伤明显。CRP作为反映炎症程度的一个经典指标，其在模型组中的表达是明显升高的，而在药物治疗后表达水平明显下降；IL-6是近年来公认为的重要的促炎症因子，其在肠组织中mRNA水平与CRP表达趋势一致；SOCS2和SOCS3的表达水平明显高于正常对照组，给予SASP治疗后，肠黏膜炎症好转，同时SOCS2、SOCS3的表达水平均下降，提示在正常情况下和结肠炎症存在的情况下，细胞因子信号的负调控可能存在差异。

细胞因子信号抑制物（SOCS）家族［7－10］，也称CIS或SSI家族，是近年来发现的新基因，是细胞因子与受体结合后通过JAK／STAT途径激活的靶基因产物，目前发现SOCS1～SOCS7及CIS1等8种蛋白组成。STAT激活诱导SOCS表达，表达的SOCS又以负反馈的形式，通过抑制JAK激酶与细胞因子受体结合的活性，以及促进蛋白酶体水解JAK、STAT蛋白等途径，抑制JAK／STAT信号通路的活化，对JAK／STAT途径进行负反馈调节。Dai等［11］研究发现，通过上调SOCS3的表达，可以抑制LPS诱导的TNF-α的产生，从而产生抗炎作用。但关于SOCS3的研究也有相反的结论，有学者研究发现对巨噬细胞给予LPS刺激后，可诱导SOCS3的表达上调，而沉默SOCS3基因后发现，LPS诱导产生的IL-6、TNF-α显著下降［12］，提示SOCS3并不是单纯的细胞因子信号抑制物，其在某些情况下并不是发挥着负向调控作用。在本次实验中，发现结肠炎模型组中SOCS3的表达水平最高，并且与疾病的严重程度一致，而且在经过治疗炎症缓解后，SOCS3的表达水平下降，这与Chaves de Souza等［13］的SOCS3表达水平与疾病严重程度相关的报道一致。关于SOCS2，既往认为SOCS2对生长激素／胰岛素样生长因子-1轴（GH／IGF-1）具有刺激作用，并认为其与肠黏膜的修复有关。目前有学者报道在Toll样受体4介导的炎症信号通路中通过诱导内源性Ⅰ型IFN的产生可间接促进SOCS2的迟发型表达［14］。在本次实验中发现，结肠炎模型组中SOCS2的表达也是上调的，药物治疗组表达显著下调，提示SOCS2的表达与机体有无炎症相关。SOCS2在炎症反应中究竟发挥着什么作用尚不清楚，有学者认为SOCS2在人单核细胞接受LPS刺激后向树突状细胞转化及成熟过程中发挥着重要的作用［15］，而且沉默SOCS2基因后可显著下调IL-6、TNF-αmRNA的表达水平，提示SOCS2参与了炎症反应中抗原呈递细胞的成熟及炎症因子的转录，药物治疗组中SOCS2表达水平的下调可能与炎症减轻及炎症细胞的数量减少有关。

本研究初步观察了SOCS2／3在UC肠黏膜局部的表达情况，SOCS作为炎症信号通路的抑制因子，随着炎症程度的加深而呈适应性增高，起到负向调控炎性因子，抑制炎症的作用。一旦炎症得以控制，其表达将逐步回归正常。所以，对于难治性UC，探索作用于SOCS靶点的药物，通过上调其表达以达到抑制炎症进展的目的，可能为UC的治疗提供一个新的策略。同时，由于SOCS的异常甲基化导致SOCS水平的降低和肿瘤的发生有一定关系，所以SOCS还可能作为治疗肠道炎症和肿瘤的新靶标。SOCS参与细胞因子信号通路的调控涉及多种因素，其在UC中的作用机制还有待进一步研究。

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（2015-01-13 收稿）

Expressions of SOCS2 and SOCS3 in Colonic Mucosa of Rats with Ulcerative Colitis

Zhou Tingting，Tong Qiaoyun△，Yuan Jinhua
Department of Gastroenterology，Yichang Central People’s Hospital，Institute of Digestive Disease of China Three Gorges University，Yichang 443000，China

Objective To investigate the expressions of suppressors of cytokine signaling 2（SOCS2）and 3（SOCS3）in colonic mucosa of rats with ulcerative colitis.Methods Thirty healthy male Sprague-Dawley rats were divided into normal control group（group A，n＝10），2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid（TNBS）-induced ulcerative colitis group（group B，n＝10）and sulfasalazine（SASP）-treated group（group C，n＝10）.Rats in group B and group C were induced with TNBS／ethanol enema，and general conditions and disease activity index（DAI）of all rats were observed.After 7days of administration with gastric perfusion，all rats were executed to evaluate tissues damage index（TDI）and colonic mucosa damage index（CMDI）；The concentrations of plasma C-reaction protein（CRP）were determined by immunoturbdimetry and the mRNA expressions of IL-6，SOCS2and SOCS3in colonic tissues were assayed by means of reverse transcriptase polymerase chain reaction（RT-PCR）and the protein expressions of SOCS2and SOCS3by Western blot.Results The DAI，TDI，CMDI and the concentrations of CRP were significantly increased in group B while compared with group A.Those were decreased in group C compared with group B（P＜0.01）.The expressions of IL-6mRNA，SOCS2and SOCS3mRNA and proteins were significantly increased in group B as compared with group A（P＜0.05），while those were declined in group C relative to group B（P＜0.05）.Conclusion SOCS2／3expressions were associated with the disease degree in ulcerative colitis，and they were up-regulated with the inflammation aggravation.

ulcerative colitis； trinitrobenzene sulfonic acid； sulfasalazine； suppressors of cytokine signaling

R574.1

10.3870／j.issn.1672-0741.2015.03.009

＊湖北省自然科学基金资助项目（No.2013-CFB-388）

周婷婷，女，1987年生，硕士研究生，E-mail:ycztthappy＠163.com△通讯作者，Corresponding author，E-mail:tongqy0904＠163.com