HPLC测定山楂叶提取物中槲皮素在大鼠体内的血药浓度及药动学研究

汪 慧，顾亚琴，舒 燕，钱巧珍，王 静，郦红岩

HPLC测定山楂叶提取物中槲皮素在大鼠体内的血药浓度及药动学研究

汪 慧，顾亚琴，舒 燕，钱巧珍，王 静，郦红岩

目的 建立高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)测定山楂叶提取物中槲皮素在大鼠体内的血药浓度，并探讨其在大鼠体内药物代谢动力学(以下简称药动学)特征。方法 SD大鼠灌胃给予山楂叶提取物，在不同的时间点眼后静脉丛取血，预处理后测定血浆中的槲皮素的浓度，经3P97软件处理数据。结果 山楂叶提取物中槲皮素在大鼠体内的药动学符合二房室模型，槲皮素能在体内较快地被吸收，且有双峰现象的出现，给药后0.25 h即达到峰浓度，峰浓度(Cmax)为(1.209±0.298) mg/L，且在3 h时出现二次吸收，主要药动学参数消除半衰期(T1/2β)=(35.461±13.75) h、周边室到中央室速率常数(K21)=(1.135±0.462)/h、中央室消除速率常数(K10)=(0.193±0.252)/h、中央室到周边室速率常数(K12)=(8.067±4.658)/h、药-时曲线下面积(AUC0-t)=(1.209±0.298) mg·h/L。结论 高效液相色谱法测定血浆中槲皮素浓度准确、简便，适用于山楂叶提取物中槲皮素的药动学研究。槲皮素双峰现象的出现，表明槲皮素在肠道中存在重吸收。

槲皮素；山楂叶提取物；药动学；高效液相色谱法

山楂叶为蔷薇科植物山里红(CrataegusPinnatifidaBge.Var.MajorN.E. Br.)或山楂(CrataegusPinnatifidaBge.)的干燥叶[1]。近年来，随着中药材资源的不断开发，采用山楂叶治疗心血管方面疾病的研究较多[2，3]。黄酮类化合物是山楂叶中的主要的化学成分，可广泛用于心血管疾病的治疗[4]。槲皮素是其中的主要黄酮成分之一[5]，研究报道槲皮素具有抗氧化、降血压、扩张血管以及保护受损心肌[6]的功效。有关槲皮素单体化合物的药动学已有相关报道[7,8]，但尚未有对山楂叶提取物中槲皮素药动学特征的报道。本实验通过研究大鼠灌胃山楂叶提取物后槲皮素的药动学，旨在揭示其在动物体内的动态变化特征，为开发心血管类药品及保健食品奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 日本岛津LC-20AT高效液相色谱仪(包括SPD-20A紫外检测器，N2000色谱工作站)；Sigma高速离心机(Sigma公司)；SK-1快速混匀器(江苏中大仪器厂)；METTLER AE240分析天平(梅特勒仪器有限公司)；微量移液器(Thermo Electron公司)。

槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所，批号：100081-200406)；山楂叶购自镇江存仁堂医药有限公司，经江苏大学欧阳臻教授鉴定为蔷薇科植物山楂的干燥叶；山楂叶提取物(自制，HPLC法测得槲皮素含量为5.157 mg/g)；甲醇、乙腈(色谱纯，江苏汉邦科技有限公司)；娃哈哈纯净水(娃哈哈集团)，其余试剂均为分析纯。

雄性SD大鼠(江苏大学动物实验中心，合格证号：SCXK(苏)2009-0002)5只，体重在(250±20)g之间。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil-5C18(250×4.6 mm，5 μm)；流动相：甲醇(A)-0.25%醋酸溶液(B)，按如下梯度洗脱：0～20 min，25%～45% A；20～25 min，45%～50% A；25～35 min，50%～80% A；流速：1 ml/min；紫外检测波长：370 nm；柱温30 ℃；进样20 μl。

1.2.2 山楂叶提取物的制备 称取干燥的山楂叶粉末60 g，置1000 ml烧瓶中，分别加入10、8倍量60%乙醇加热回流提取2次，每次1 h，过滤，滤渣用60%乙醇润洗，合并滤液，浓缩并干燥即得，经HPLC测得提取物中槲皮素含量为5.157 mg/g。

1.2.3 对照品溶液的配制 精密称取槲皮素对照品适量置10 ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，制得含槲皮素66.8 mg/L的对照品溶液。

1.2.4 血浆样品预处理 精密吸取血浆0.1 ml，加0.2 ml乙腈沉淀蛋白，涡流振荡1 min，高速离心(13 000 r/min)10 min，取上清0.45 μm微孔滤膜滤过，进样20 μl。

1.2.5 方法学考察

1.2.5.1 方法的专属性 将空白血浆、空白血浆中加入槲皮素对照品、灌胃山楂叶提取物血浆样品按1.2.1色谱条件下进样，考察槲皮素主峰的特异性，是否与其他峰分离度良好。

1.2.5.2 线性范围及检测限 精密吸取槲皮素对照品溶液适量，置于1 ml离心管中，加入大鼠空白血浆100 μl，配制成槲皮素浓度为0.167、0.334、0.668、1.670、3.340、6.680 mg/L的血浆样本，并进行色谱分析，以峰面积Y对血药浓度X进行线性回归，线性方程为Y=7136.5X+139.42(R2=0.9998)。

1.2.5.3 准确度和精密度 配制含槲皮素0.223、0.835、3.340 mg/L的低、中、高浓度的血浆样品，各浓度测5次，连续测定5 d，计算槲皮素的含量，计算方法的准确度和精密度。

1.2.5.4 提取回收率 配制含槲皮素0.223、0.835、3.340 mg/L的低、中、高浓度的血浆样品各5份，进样20 μl，测定得到峰面积(5次测定的平均值)A1；以同时配制等浓度的对照品溶液进样得到的峰面积(5次测定的平均值)A2作为对照，计算得低、中、高3个质量浓度的血浆样品中槲皮素的提取回收率(R=A1/A2×100%)。

1.2.5.5 稳定性考察 配制含槲皮素的低、中、高3个浓度0.223、0.835、3.340 mg/L的血浆样品，考察室温放置稳定性、临时储存稳定性及长期储存稳定性。

1.2.6 药动学研究 大鼠给药前禁食不禁水，灌胃给药山楂叶提取物2.4 g/kg(给药剂量按槲皮素算为12.38 mg/kg)，并于给药前和给药后0.083、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、12 h眼眶后静脉丛取血，置于肝素化离心管中，分离血浆，-20 ℃保存。再按“1.2.4血浆样品预处理”项步骤操作。

2 结 果

2.1 方法的专属性 空白血浆、空白血浆中加入槲皮素对照品、灌胃山楂叶提取物血浆样品色谱图见图1，槲皮素与其他干扰组分分离效果良好，无杂质峰干扰。

2.2 线性范围及检测限 血浆中槲皮素在0.167～6.68 mg/L之间线性关系良好，血浆中检测限为0.0468 mg/L。

2.3 准确度和精密度 该检测方法的准确度及精密度结果见表1。

2.4 提取回收率 低、中、高3个质量浓度的血浆样品中槲皮素的提取回收率分别为81.4%，85.2%，83.7%，平均提取回收率为83.4%，符合药动学实验要求。

2.5 稳定性考察 血浆样品预处理后室温下放置36 h稳定；样品经4 ℃冰箱储存5 d保持稳定；样品在-20 ℃冻存2周稳定。

2.6 药动学结果 血药浓度数据见表2，用3P97药动学程序对血药浓度数据拟合计算，结果表明山楂叶提取物中的槲皮素在大鼠体内的药动学符合二房室模型，主要的药动学参数见表3，其平均药-时曲线见图2。

表1 血浆样品中槲皮素的准确度和精密度 ±s)

表2 5只雄性SD大鼠不同时间血药浓度数据

注：NO.1、NO.2、NO.3、NO.4、NO.5为大鼠编号

图1 大鼠血浆样品中槲皮素的HPLC色谱图

图2 山楂叶提取物中槲皮素在大鼠体内的药-时曲线

主要药动学参数槲皮素Ka(/h)10.173±6.281Α(/h)5.174±1.672T1/2β(h)35.461±13.75K21(/h)1.135±0.462K10(/h)0.193±0.252K12(/h)8.067±4.658AUC0-t(mg·h/L)6.108±3.217Tmax(h)0.25;3Cmax(mg/L)1.209±0.298

3 讨 论

血浆样品处理方法比较了甲醇、乙腈、6%高氯酸等溶剂，通过综合比较杂质干扰及提取回收率因素，发现甲醇沉淀蛋白效果不如乙腈，6%高氯酸沉淀蛋白效果较好，但会对色谱柱造成一些损害，故采用乙腈沉淀蛋白法。同时考察了不同体积比的血浆-乙腈(1∶2，1∶3，1∶4)对槲皮素测定的影响，结果随着乙腈体积比的加大，血浆杂质峰并没有明显减少(与血浆-乙腈体积比1∶2相比)，故选定以血浆-乙腈(1∶2)作为沉淀蛋白条件。本研究中，大鼠灌胃山楂叶提取物后槲皮素在大鼠体内药动学过程符合二室模型。槲皮素在胃肠道能迅速被吸收吸收速率常数(Ka)=(10.214±5.911)/h，且灌胃后血浆中的槲皮素在0.25 h达峰值(1.209±0.298)mg/L，说明槲皮素进入大鼠体循环后能迅速地分布分布速率常数α=(5.124±1.588)/h，从而发挥药效迅速。同时在研究中还发现槲皮素在体内的过程出现主峰与次峰，即双峰现象，表明槲皮素在肠道中存在二次吸收。文献[9]报道，某些药物因肝肠循环在体内可出现二次吸收峰(双峰现象)，而此重吸收过程有可能是导致槲皮素在体内T1/2β长的原因。另一方面，槲皮素的代谢存在肠肠循环，Crespy等[10]利用大鼠空肠和回肠进行槲皮素和芦丁原位灌流实验，表明其有效吸收部位可能在肠道上段，并发现2/3的槲皮素在灌流过程中吸收进入肠壁，但同时又有52%的槲皮素以结合物的形式(葡萄糖醛酸甙或硫酸甙)重新分泌入肠腔。由于本研究对象为山楂叶的提取物，为山楂叶中某一系列化合物的混合物，所以不能排除同类的黄酮化合物在体内转化为槲皮素被吸收进入体循环，而且各个化学成分之间的相互作用都有可能导致槲皮素的吸收、分布及代谢等发生变化。本研究结果为山楂叶的新药开发及后续临床给药方案研究提供了实验依据。

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(2015-01-27收稿 2015-03-02修回)

(责任编辑 张亚丽)

Study on pharmic concentration and its pharmacokinetics of quercetin in extract of hawthorn leaves in rats by HPLC

WANGHui,GUYaqin,SHUYan,QIANQiaozhen,WANGJing,andLIHongyan.

JiangsuJibrierPharmaceuticalJointStockLimitedLiabilityCompany,Zhenjiang212009,China

LIHongyan,E-mail:lhy707@126.com

Objective To establish a high performance liquid chromatography (HPLC) method for measuring the pharmic concentration of quercetin in extract of hawthorn leaves in rats and to study its pharmacokinetics. Methods Blood sample were collected through venous plexus in rat eye at different time after oral administration of the extract of hawthorn leaves. After liquide extraction with acetonitrile, the concentration of quercetin in plasma was measured. Then pharmacokinetics parameters were calculated with 3P97 program. Results The results showed that quercetin plasma concentration-time curves in rats coincided with two-compartment model, quercetin was absorbed fast in rats, and it has twin peaks. peak concentration(Cmax) of quercetin in rat plasma was (1.209±0.298) mg/L. It has a secondary absorption peak at 3 h. The main pharmacokinetic parameters were as follows:elimination half time(T1/2β) was (35.461±13.75) h, rate constant of central chamber and peripheral chambers(K21) was (1.135±0.462)/h, elimination rate constant of central chamber(K10) was (0.193±0.252)/h, rate constant of central chamber and peripheral chambers(K12)was (8.067±4.658)/h,area under the concentration-versus-time curve(AUC0-t)was (1.209±0.298)mg·h/L. Conclusions HPLC method is accurate and sensitive. The twin peaks indicats that quercetin has a reabsorption in the intestines.

quercetin；hawthorn leaves extracts; pharmacokinetics; HPLC

10.13919/j.issn.2095-6274.2015.03.008

汪 慧，本科学历，执业药师，E-mail:5062342765@qq.com

212009 镇江，江苏吉贝尔药业股份有限公司

郦红岩，E-mail: lhy707@126.com

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