石斛合剂调控老年糖尿病大鼠GLP-1的研究*

刘 赟，施 红，林心君，郑晓玲，许 茜

（福建中医药大学，福州 350122）

胰高血糖素样多肽-1（GLP-1）是在回肠与结肠的L细胞产生的一种肠促胰素，其受体分布在胰岛α、β细胞、周围神经系统、胃肠道和心、肾、肺等重要器官[1]。GLP-1除了能抑制β细胞凋亡以外，还能促进胰岛β细胞增殖和再生，促进胰岛素，胰高血糖素的分泌等[2-3]。因此其在治疗糖尿病（DM）的领域越来越引起人们的重视。本研究通过测定不同时间段血清GLP-1的浓度，探讨石斛合剂（DC）通过调控GLP-1治疗DM的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物 雌性Wistar大鼠,SPF级，67只，体质量（220±30）g。

1.2 药物 石斛合剂药物组成：石斛、黄芪、五味子、丹参、葛根、玄参等。低、高剂量生药含量分别为：2、4 g/mL，灭菌后100 mL分装1瓶，分装保存备用。二甲双胍缓释片配制浓度：5 g/L，备用。

1.3 试剂 乌拉坦（氨基甲酸乙酯），大鼠GLP-1测定试剂盒等。

1.4 造模方法，实验分组及给药

1.4.1 造模 适应性喂养7d后，将大鼠按随机数字表法随机分为两组:正常组13只、造模组54只。根据前期研究,正常组给予基础饲料喂养，造模组给予高脂高糖饲料。1 a后，造模组按20 mg/kg腹腔注射链脲菌素（STZ）。3 d后筛出成模大鼠（血糖≥16.7 mmol/L），剩余大鼠再次腹腔注射STZ、检测血糖，选出成模大鼠。

1.4.2 实验分组及给药 采用随机数字表法随机将成模大鼠分为正常组（13只）、模型组（15只）、DC低剂量组（14只）、DC高剂量组（12只）、对照组（13只）。正常组、模型组予生理盐水灌胃，对照组予二甲双胍50 mg/（kg·d）灌胃，DC低、高剂量组按生药量分别予DC 12 g/（kg·d）、24 g/（kg·d）灌胃，24 d后取材。

1.5 观察指标及检测方法 大鼠剪尾，酶联免疫吸附法（ELASA法）检测大鼠0.5、2.5 h血清GLP-1。处死，取小肠，免疫组化方法检测大鼠小肠GLP-1。

2 结果

2.1 石斛合剂对糖耐量实验后0.5、2.5 h大鼠血清GLP-1水平及其差值的影响 见表1。

通过监测糖耐量实验后0.5 h以及2.5 h GLP-1水平发现，0.5 h GLP－1结果显示：与模型组比较，DC低剂量组无统计学差异（P＞0.05），DC高剂量组显著高于模型组（P＜0.01）。2.5 h GLP-1结果显示:与模型组比较，DC低剂量组、DC高剂量组无统计学差异（P＞0.05）。0.5 h与2.5 h GLP-1水平的差值比较：与模型组比较，DC低剂量组低于模型组（P＜0.05），DC 高剂量组显著高于模型组（P＜0.01）。

表1 糖耐量实验后0.5、2.5 h大鼠血清GLP-1水平及差值的比较（s）pmol/L

表1 糖耐量实验后0.5、2.5 h大鼠血清GLP-1水平及差值的比较（s）pmol/L

注:与正常组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

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2.2 石斛合剂对大鼠GLP-1水平的影响 见图1。

图1 小肠GLP-1免疫组化图片(×200)

通过观察小肠GLP-1免疫组化图片发现，正常组、模型组、对照组、DC低剂量组、DC高剂量组都未见阳性表达。正常组小肠肠上皮排列整齐，肠腺未见阳性表达，肠绒毛固有层可见部分黄褐色，为血液污染；模型组小肠固有层内空泡明显增多，肠腺未见阳性表达，肠绒毛固有层可见部分黄褐色，为血液污染；对照组、DC高、低剂量组小肠固有层内空泡较正常组有所增多，肠腺未见阳性表达，肠绒毛固有层可见部分黄褐色，为血液污染。

3 讨论

随着社会经济的发展和生活方式的改变，糖尿病的患病率呈上升趋势，成为危害人类健康的全球性问题。中医认为2型糖尿病病位在脾（胃）、肝、肾为主，涉及心肺，阴虚或气阴两虚为本，痰浊血瘀为标，多虚实夹杂[4-6]。初期为情志失调，痰浊化热伤阴，以标实为主。继之为气阴两虚，最后阴阳两虚，兼夹痰浊瘀血，以本虚为主[7-9]。基础研究发现，石斛合剂基础方能使细胞内溶酶体活性增强，自噬途径的胞内降解增加，从而使高血糖大鼠模型肝、肾的自噬表达增强[10]。另外，细胞培养显示含石斛合剂基础方的血清能保护胰岛细胞并减轻STZ对胰岛细胞的损伤[11]。还有报道表明石斛合剂能促进GLP-1、胰岛素分泌，抑制胰高血糖素分泌，逆转糖尿病动物延迟的血糖高峰、改善胰腺等组织结构，改善糖脂代谢的作用，能抑制胰腺凋亡相关基因P53、Bax mRNA及蛋白表达等作用[12-14]。

本实验采用石斛合剂对大鼠进行近1个月的治疗发现，通过监测糖耐量实验后0.5 h以及2.5 h GLP-1水平发现，0.5 h GLP－1结果显示：与模型组比较，DC低剂量组无统计学差异（P＞0.05），DC高剂量组显著高于模型组（P＜0.01）。2.5 h GLP-1结果显示:与模型组比较，DC低剂量组、DC高剂量组无统计学差异（P＞0.05）。0.5 h与2.5 h GLP-1水平的差值比较：与模型组比较，DC低剂量组低于模型组（P＜0.05），DC 高剂量组显著高于模型组（P＜0.01）。通过观察小肠GLP-1免疫组化图片发现，正常组、模型组、对照组、DC低剂量组、DC高剂量组都未见阳性表达。正常组小肠肠上皮排列整齐，肠腺未见阳性表达，肠绒毛固有层可见部分黄褐色，为血液污染；模型组小肠固有层内空泡明显增多，肠腺未见阳性表达，肠绒毛固有层可见部分黄褐色，为血液污染；对照组、DC高、低剂量组小肠固有层内空泡较正常组有所增多，肠腺未见阳性表达，肠绒毛固有层可见部分黄褐色，为血液污染。未发现GLP-1阳性表达的原因可能是因为GLP-1在体内的代谢比较快，半衰期仅1～2 min，故用免疫组化的方法比较难检测出。

综上所述，低剂量DC组虽然不能使大鼠0.5 h及2.5 h GLP-1水平显著提高，但是通过比较这两个时间段GLP-1水平，发现GLP-1水平下降很少，与模型组有统计学差异（P＜0.05）；而高剂量DC组能使大鼠0.5 h GLP-1水平显著提高，与模型组有统计学差异（P＜0.01）。DC低剂量组呈现减少GLP-1降解，而DC高剂量组则更多呈现促进GLP-1分泌，说明低剂量DC可能是通过在一定时间内，抑制雌性SD大鼠体内GLP-1降解而达到降血糖的作用；高剂量DC则可能是通过增加GLP-1水平而达到降血糖的目的。

[1]余文珍,施 红,郑燕芳,等.石斛合剂对衰老糖尿病大鼠血清GLP-1水平的影响[J].海南医学院学报,2006,12(3):196-199.

[2]Beckman LM,Beckman TR,Earthman CP.Changes in gastrointestinal hormones and leptin after Rouxen-Y gastric bypass procedure：a review[J].J Am Diet Assoc,2010,110(4):571-584.

[3]郑远燕,施 红,崔 乙.GLP-1调控胰岛细胞增殖、凋亡的信号分子机制及中西药的研究[J].世界中医药,2012,9(7):463-466.

[4]贾 明,贾德林,于 阳,等.贾德林教授关于糖尿病并发冠心病中医病机新理论简介[J].天津中医药大学学报,2008,27(4):250-251.

[5]栗德林,闫秀峰.糖冠康胶囊治疗2型糖尿病合并冠心病的临床与机制研究[J].中医药学报,2003,31(1):11-12.

[6]杨彩凤,曹 茜,沈永明.2型糖尿病中医证候研究进展[J].天津中医药大学学报,2008,27(2):106-109.

[7]冯连笑.活血通络法治疗糖尿病周围神经病变研究概况[J].天津中医药,2011,28(5):438-440.

[8]王庆向.养阴温肾活血法治疗糖尿病肾病临床观察[J].天津中医药,2010,27(2):105-106.

[9]周 晖,商学征,谢培凤,等.益气养阴解读通络法治疗早期糖尿病肾病的临床研究[J].天津中医药,2009,26(2):100-102.

[10]郑雪花,钱长晖,何才姑.石斛合剂对糖尿病大鼠肾脏自噬表达的影响[J].福建中医学院学报,2010,20(1):27-28.

[11]郑燕芳,施 红,杨秀珍.石斛合剂对胰岛细胞分泌功能的影响[J].中国医院药学杂志,2010,30(7):551-552.

[12]林 雅,施 红,余文珍,等.石斛合剂对四氧嘧啶糖尿病大鼠影响的实验研究[J].福建中医学院学报,2005,15(2):30-33.

[13]余文珍,施 红,郑燕芳,等.石斛合剂对糖尿病大鼠血清GLP-1水平的影响[J].海南医学院学报,2006,12(3):196-199.

[14]施 红,金国琴,高尤亮,等.石斛合剂对衰老糖尿病大鼠胰腺组织凋亡相关基因Bax，Bcl-2 mRNA及蛋白表达的调控[J].中国老年学杂志,2006,16(1):57-59.