ATDC5：一株反映软骨形成完整过程的细胞系*

冯其帅，高丽娜，崔元璐

ATDC5：一株反映软骨形成完整过程的细胞系*

冯其帅，高丽娜，崔元璐

（天津中医药大学中医药研究院，天津300193）

中医学认为，筋骨失养，系肝肾虚衰所致。补肾中药的某些有效成分具有与细胞因子、激素类似的生理活性和广泛的药理作用，不仅可用于骨性关节炎的治疗，而且在组织工程及干细胞工程领域有广泛的应用前景。ATDC5细胞株来源于小鼠畸胎癌株AT805，作为一个前软骨细胞株其分化过程与软骨形成过程类似。在细胞因子、激素和无机磷酸盐等作用下，ATDC5细胞将发生增殖、聚集进而进入软骨细胞分化阶段，分化为增殖性软骨细胞。增殖性软骨细胞随后继续分化为肥大性软骨细胞，从而进入终末分化阶段，软骨基质发生矿化，最终沉积成骨。通过从系统调节因子、局部调节因子和细胞培养条件三个方面，揭示ATDC5细胞增殖、分化与矿化的分子机制，为软骨发育研究及中药有效成分高通量筛选提供理论依据。

细胞生物学；补肾中药；ATDC5细胞；软骨形成；软骨细胞

软骨形成过程始于间充质细胞增殖、聚集，其后逐步地分化为增殖性软骨细胞，而增殖性软骨细胞发生肥大化后分化为无增殖活性的肥大软骨细胞，进而肥大软骨细胞发生矿化进入终末分化阶段，最终被骨组织取代。ATDC5细胞株来源于小鼠畸胎癌株AT805，作为一个前软骨细胞株其分化过程与软骨形成过程类似。研究表明，ATDC5细胞增殖、分化以及矿化阶段均可受诱导分化因子的影响，从而加速某一阶段的进程或者增强某一阶段的特征性软骨基质的表达。在软骨细胞分化早期，ATDC5细胞通过细胞聚集形成软骨小结并表达相应的特征性软骨基质，如聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、Ⅱ型胶原蛋白（Collagen typeⅡ）等。伴随着软骨基质发生矿化，ATDC5细胞进入终末分化阶段，同时表达Collagen typeⅩ、碱性磷酸酶等标志性产物。研究证明，ATDC5细胞不仅具有稳定地表达软骨细胞外基质的能力，而且具有较强的增殖能力而便于体外扩增培养。

中医认为，肾藏精，主骨生髓，髓藏于骨腔内，滋养骨骼［1］。现代药理学表明，补肾壮骨中药不仅能够延缓软骨的损伤、降解以及退变，而且可以促进软骨分化与修复［2］。本文将从系统调节因子、局部调节因子和细胞培养条件三个方面，揭示不同调节因子与ATDC5细胞的增殖、分化以及矿化之间的相互关系，为探究补肾壮骨中药软骨保护作用的分子机制提供一个展示软骨形成过程的细胞药理学模型。

1　系统调节因子

1.1生长激素（GH）/胰岛素样生长因子-1（IGF-1）系统生长激素具有广泛的生物学功能，其主要表现为具有促合成与生长发育的作用。在软骨形成过程中，生长激素可以促进软骨细胞的增殖与分化，调节蛋白质、糖及脂肪的代谢［3］。一般认为，IGF-l通过介导生长激素从而发挥促进骨增长的作用，进而形成了GH/IGF-l功能系统［4］。Koike等［5］对ATDC5细胞进行成纤维细胞生长因子受体-3（FGFR3）突变诱导，MTT实验结果显示FGFR3突变的细胞增殖被抑制进而细胞凋亡。进一步研究发现，ATDC5细胞培养过程中加入IGF-1，IGF-1通过丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信号通路可以促进细胞增殖和抑制细胞凋亡。IGF-1可以介导生长激素对软骨发育不全患者的治疗过程，其机制可能为通过PI3K和MAPK通路抑制FGFR3突变导致的凋亡。此外，生长激素可直接作用于生长激素受体而发挥其调控作用［6］。根据相关报道，ATDC5细胞自身可以表达内源性生长激素受体。利用生长激素诱导ATDC5细胞研究发现，生长激素通过直接作用于生长激素受体诱导STAT5磷酸化促进Collagen typeⅡ的表达从而加速ATDC5细胞早期分化的进程［7］。

1.2甲状腺素甲状腺素具有广泛而复杂的生理作用，尤其对骨骼发育起着至关重要的作用［8］，其中先天甲状腺素分泌不足将导致侏儒症发生。3，5，3，-三碘甲状腺原氨酸（T3）和3，5，3，'5'-四碘甲状腺原氨酸（T4）是甲状腺素两种主要的活性成分。分子生物学研究表明，甲状腺素能够靶向作用于软骨发育调控基因，从而加速软骨细胞趋向于肥大软骨细胞分化的进程，促进软骨基质矿化，最终实现协调软骨形成过程的作用［9］。Miura等［10］研究发现，T3可以增强茜素红S染色而对阿利新蓝染色无影响，表明T3对ATDC5细胞的作用主要表现为促进终末分化而对早期分化无明显作用。Siebler等［11］也发现T3可以抑制ATDC5细胞增殖，诱导碱性磷酸酶和Collagen typeⅩ的表达，加速软骨细胞向成骨细胞分化。在软骨分化发育过程中，T4可以被激活转化为T3从而调控软骨形成。

在软骨细胞增殖与分化过程中，成纤维细胞生长因子（FGFs）是重要调节因子之一，其中FGFR3基因突变可以引起软骨发育不全。研究发现，T3通过靶向于FGF/FGFR信号通路中关键蛋白HSPGs来调控ATDC5细胞分化发育［12］。在软骨形成阶段，T3能够激活FGF2和FGF18调控ATDC5细胞的增殖与分化［13］。除此之外，Ihh/PTHrP与甲状腺素的代谢和其活性成分T3存在着密切的联系，介导T3调控软骨形成过程。

1.3雌激素雌激素属于类固醇激素，靶向于细胞内雌激素受体（ER）发挥作用。雌激素受体是核受体超家族的成员，具有转录因子的作用，包括ERα和ERβ两种亚型［14］。雌激素对骨的作用可能是通过介导调控成骨细胞、成骨细胞前体、骨细胞和生长骨板的软骨细胞ERα而实现的。为了探讨雌激素对ATDC5细胞增殖的影响，Zheng等［15］利用10-11～10-8mol/L雌激素诱导ATDC5细胞，发现雌激素可以促进细胞增殖并且表现出时间和剂量依赖性。进一步研究发现，雌激素的作用机制为促进CNP信号通路中CNP、NPR-B和NPR-C蛋白表达而实现的。在软骨细胞对数生长期，雌激素与瘦素相辅相成，调控软骨发育过程。研究发现，在ATDC5细胞中，雌激素与瘦素受体均有表达。雌激素可以通过雌激素受体促进瘦素受体的表达，而瘦素也可以通过ERK信号通路促进雌激素受体的表达，从而加速ATDC5细胞肥大化过程，促进其分化为成骨细胞［16-17］。

1.4骨保护素骨保护素是一种骨代谢过程的中介分子，介导多种细胞因子和激素对破骨细胞分化与活化的负性调节作用［18］。骨保护素是核因子（NF）NF-κB受体活化因子配体（RANKL）的假受体，具有高度的RANKL亲和力。通常认为，骨保护素以竞争性结合的方式抑制核因子κB受体活化因子（RANK）与RANKL的结合，阻断级联反应从而抑制破骨细胞的形成以及骨吸收［19］。在ATDC5软骨分化过程中，骨保护素和RANK两者均可以表达，两者相互结合从而抑制RANK的表达，进而抑制ATDC5细胞趋向破骨细胞分化而促进其增殖与分化［20］。

1.5糖皮质激素糖皮质激素是人体在生理状态下分泌的［21］。在关节炎治疗中，地塞米松、氢化可的松、泼尼松等糖皮质激素作为抗炎药物经常被使用。在治疗过程中，发现地塞米松能够抑制骨骼发育，尤其是抑制软骨细胞的增殖。同样研究表明，地塞米松可抑制ATDC5细胞增殖和蛋白多糖的合成，其抑制蛋白多糖的机制是通过调控PI3K/Akt信号通路从而抑制Runx2转录因子实现的［22］，而抑制细胞增殖的机制是通过诱导细胞自噬而实现的［23］。

1.6胰岛素胰岛素与IGF-I相类似，具有异二聚体α2 β2蛋白结构以及相似的下游信号通路和受体靶点。两者均可通过胰岛素受体（IR）、IGF-IR和IR/IGF-IR结合发挥其调节软骨细胞增殖和分化的作用。Yao等［24］使用分别含有分化因子、生长因子和胰岛素的细胞培养基对ATDC5细胞进行培养，观察不同诱导分化因子对软骨细胞分化发育的影响。实验结果表明，3种细胞培养基均可以促进ATDC5细胞的增殖，其中以含有胰岛素的细胞培养基作用最为显著。此外，含有分化因子的细胞培养基可显著地增强软骨细胞分化特征性基质的表达，而含有胰岛素的细胞培养基可以促进软骨细胞矿化特征性基质的表达。重要的是ATDC5细胞在含有胰岛素的细胞培养基中培养时，其总糖胺聚糖表达量是最高的。胰岛素对ATDC5细胞的作用主要表现为促进细胞增殖和加速软骨细胞功能的表达。

2　局部调节因子

2.1转化生长因子-β（TGF-β）在软骨形成过程中，TGF-β通过激活经典与非经典的Smad通路调节软骨特定功能蛋白的基因表达，涉及到软骨细胞聚集、增殖、细胞外基质合成以及矿化等各个阶段［25］。在软骨细胞分化早期，TGF-β以激活Smad 3与转录因子形成复合物的方式，募集CREB/p300到Collagen typeⅡ启动子上从而增强其表达。在ATDC5细胞中研究发现，TGF-β主要通过两种方式实现对ATDC5细胞诱导分化作用：一方面通过Smad 3从而启动软骨基质的表达。另一方面通过p38/ERK1/2通路维持软骨基质长期的表达。Watanabe等［26］对TGF-β诱导ATDC5细胞软骨基质表达的作用及其机制进行了研究。结果表明，在细胞培养基中添加TGF-β，可迅速地促进ATDC5细胞中蛋白聚糖的表达。分子机制研究发现，无论处于增殖期还是分化期，TGF-β对蛋白聚糖的诱导作用均由ERK1/2和p38 MAPK信号通路所介导。Han等［27-28］对增殖期ATDC5细胞给予TGF-β1诱导，培养12 d后，蛋白聚糖和Collagen typeⅡ的表达均显著上调，并具有时间、依赖性。在ATDC5细胞中，TGF-β1可以调控SRp40的表达从而促进纤维蛋白表达，纤维蛋白通过RGDS多肽调控蛋白聚糖和多功能蛋白聚糖之间的平衡［29］。

2.2骨形态发生蛋白（BMPs） BMPs属于TGF-β超家族，是一类具有促软骨形成作用的内源性蛋白。处于不同分化阶段的ATDC5细胞将表达不同类型的内源性BMPs。其中，BMP-2在软骨细胞分化各个阶段均可以表达；BMP-6在软骨小结形成阶段表达上调；BMP-7在细胞钙化阶段才可以被检测到［30］。

作为诱导成骨细胞分化重要的细胞外信号分子之一，BMP-2是软骨形成过程中间充质细胞分化所必需的调节因子，其发挥作用主要涉及到两条信号通路：BMP-2/Smads/Runx2/Osterix信号通路和BMP-2/Smads/Msx2/Osteri信号通路［31］。Shukunami等［32］研究发现，BMP-2上调Collagen typeⅩ和ALP基因表达同时下调Collagen typeⅡ基因的表达，从而促进ATDC5细胞分化为肥大软骨细胞。体外实验发现，BMP-7可以促进软骨细胞外基质合成进而促进软骨细胞早期分化［33-34］。Caron等［35］将BMP-7与BMP-2以微克级浓度诱导处于分化期ATDC5细胞，分析BMP-7与BMP-2对ATDC5细胞差异性作用。实验结果显示，BMP-2可以促进ATDC5细胞Collagen typeⅩ、ALP、Runx2和MMP-13等软骨细胞肥大化特征性产物的表达，而BMP-7促进软骨细胞分化特征性基因Aggrecan、Collagen typeⅡ和Sox9的表达而抑制矿化产物的表达。由此表明，BMP-2是肥大软骨细胞的诱导因子，而BMP-7是增殖性软骨细胞的诱导因子。

2.3Sox9Sox9作为一个重要转录因子，在软骨细胞早期分化中扮演着极其重要的角色。首先，Sox9与软骨细胞特异增强子Col2α1结合从而直接调控Collagen typeⅡ表达［36］；其次，L-Sox5、Sox6与Sox9三者能够形成蛋白复合物，相互协同作用于Col2α1增强子序列从而促进Collagen typeⅡ的表达。Sox9也可以通过结合于PTHrP基因的启动子区增加PTHrP基因启动子活性，进而促进软骨细胞增殖和分化［37］。此外，Wnt/β-catenin和TGF-β/Smad信号通路通过调控Sox9从而参与到软骨细胞早期分化过程中［38］。

在ATDC5细胞中，存在着一个负责调控Sox9基因表达的含有30个碱基对的增强子。Ushita等［39］研究发现NF-κB RelA可以促进ATDC5细胞表达Collagen typeⅡ，其作用机制为NF-κB RelA靶向结合Sox9增强子，调控Col2a1基因从而促进软骨基质Collagen typeⅡ的表达。低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP4）是一种Wnt信号通路抑制剂。Asai等［40］对LRP4在ATDC5细胞分化过程中的作用进行了相关研究，结果表明LRP4通过阻断Wnt/β-catenin信号通路而增强Sox9基因表达而促进软骨基质Collagen typeⅡ和Aggrecan的表达，促进ATDC5细胞早期分化。

2.4Runx2作为软骨细胞成熟的调控中心，Runx2已经成为目前研究的热点。Runx2是软骨形成过程中沉积阶段的特征性产物，在前肥大软骨细胞和肥大软骨细胞中表达量显著上升，而在增生性软骨细胞中，其表达量明显下降［41］。在ATDC5细胞中，Runx2的表达量在其肥大化阶段、增殖与分化阶段显著增加。Runx2可以通过促进Collagen typeⅩ表达来加速ATDC5细胞向肥大软骨细胞分化［42］。Runx2在ATDC5细胞成熟过程中发挥着重要的作用。利用siRNA技术干扰ATDC5细胞Runx2的表达，发现肥大化的ATDC5细胞成骨特征性产物的表达降低，减缓软骨细胞成熟进程［43］。

3　细胞培养条件

3.1无机磷酸盐在软骨形成过程中，无机磷酸盐可以加速增殖性软骨细胞向肥大性软骨细胞分化，促进软骨细胞的成熟以及细胞外基质矿化进程。Magne等［44］利用 CaCl2和 NaH2PO4/Na2HPO4调节ATDC5细胞培养基中无机磷、钙的浓度，观察细胞成熟和矿化情况。研究表明，无机磷酸盐可以增加ATDC5细胞Collagen type X的表达，诱导软骨细胞发生矿化。此外，无机磷酸盐也可以通过降低Bcl-2/Bax比值、DNA片段化和激活Caspase-3从而诱导ATDC5细胞凋亡。

3.2维生素C维生素C在骨与软骨发育过程中发挥着至关重要的作用。对于许多间充质来源的细胞，如脂肪细胞、成骨细胞、成肌细胞和软骨细胞，维生素C是一种必要的诱导分化因子［45］。维生素C缺乏将导致软骨细胞增殖缓慢、软骨基质合成降低以及成骨细胞数量减少。目前，很多研究工作都在ATDC5细胞培养基中加入维生素C，其目的在于促进ATDC5细胞增殖和分化，从而缩短实验周期［46-47］。在细胞培养基中加入高剂量的维生素C，可使ATDC5细胞软骨基质Aggrecan、Collagen typeⅡ和Collagen typeⅩ的表达显著地增加，软骨细胞增殖与分化阶段的时间由21 d缩短为7 d，同时软骨肥大分化阶段也显著地得到增强［48］。

4　结论

在软骨形成过程中，软骨细胞一般需要经历3个不同分化阶段：前软骨细胞、增殖性软骨细胞和肥大性软骨细胞。在诱导分化因子作用下，ATDC5细胞展现出了分化为不同特征性软骨细胞的潜力。在生长激素、IGF-1、骨保护素、TGF-β、BMP-7和Sox9等调节因子的作用下，ATDC5细胞趋向分化为增殖性软骨细胞，分化早期阶段特征性产物表达升高，其增殖与分化过程得以加快。在甲状腺素、雌激素、BMP-2、Runx2、无极磷酸盐等调节因子的作用下，ATDC5细胞趋向分化为肥大化软骨细胞，进而成熟分化为成骨细胞，分化晚期阶段特征性产物表达升高，其矿化与成骨的过程得以加速。

综上所述，ATDC5细胞可作为一个体外细胞药理学模型，反映软骨形成中软骨细胞增殖、分化与矿化的完整过程，用以筛选具有促软骨分化发育作用的中药方剂或中药的活性成分，便于揭示补肾中药在软骨细胞增殖、分化以及矿化各个阶段调控作用的分子机制。

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ATDC5:A well-characterized cell line of reflecting a complete chondrogenesis progress

FENG Qi-shuai，GAO Li-na，CUI Yuan-lu
（Research Center of Traditional Chinese Medicine，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

The malnutrition of bone and muscle is caused by the failure of liver and kidney in traditional Chinese medicine.Some effective components，isolated from nourishing kidney drugs have the widely pharmacological effects，which is similar to cytokines or hormones that are used for osteoarthritis treatment，tissue engineering and stem cell engineering.ATDC5 cell，derived from mouse teratocarcinoma AT805，is characterized as a chondrogenic cell line which goes through a sequential process analogy to chondrogenesis.Under the effects of the differentiation factors，such as cytokines，hormones，inorganic phosphate，etc，ATDC5 cells proliferate，gather and differentiate into proliferating chondrocytes.And then mineralized matrix is produced and proliferating chondrocytes subsequently differentiate into hypertrophic chondrocytes and are gradually replaced by bone.From system regulation factors，local regulation factors and cell culture conditions，this review will reveal the molecular mechanism of proliferation，differentiation and mineralization of ATDC5 cell，which provides the theory basis for cartilage development researches and high-throughput screening of effective components of Chinese traditional medicine.

cell biology；nourishing kidney drugs；ATDC5 cell；chondrogenesis；chondrocytes

R285.5

A

1673-9043（2015）06-0379-06

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.12.16

国家自然科学基金项目（81473542）；教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20131210110008）。

冯其帅（1990-），男，硕士研究生，从事中药药理学研究。

崔元璐，E-mail:cuily@tju.edu.cn。

（2015-08-19）