TLR4/NF-B在国人膝关节 OA关节软骨中表达的实验研究

俞银贤 陈金伟 阮琪 马春辉 易诚青*马金忠

俞银贤 陈金伟 阮琪 马春辉 易诚青*马金忠

目的 通过研究人膝关节晚期骨性关节炎（osteoarthritis,OA）中Toll样受体4/核因子-B（Toll-like receptor 4/nuclear factor kappaB,TLR4/NF-B）的表达，初步探讨自身免疫在OA发病机制中的作用。方法 选取2013年9月～11月行全膝关节置换手术的20名膝关节OA患者（平均年龄68.5岁），取胫骨负重区及非负重区软骨，对照组为12名因创伤性股骨颈骨折行全髋关节置换术患者（平均年龄66.3岁）的股骨头负重区软骨。采用免疫组化方法分析各组软骨中TLR4的表达情况；运用RT-PCR和Western Blot技术检测三组标本软骨中TLR4、NFBp65的mRNA和蛋白表达。结果 1.免疫组化结果显示TLR4在负重区软骨中表达最高，非负重区其次，对照组正常软骨表达最少。2.RT-PCR及Western Blot检测软骨中TLR4、NF-B的mRNA及蛋白含量，结果显示负重区软骨同样表达最高，对照组表达最低，且运用Kruskal-Wallis秩和检验方法分析显示＜0.05，组间具有统计学差异。结论TLR4/NF-B在OA的软骨负重区表达明显上调，提示TLR4/NF-B信号通路介导的自身免疫可能参与了OA的发病机制。

骨关节炎；TLR4；NF-B；软骨；自身免疫

OA是临床常见病，危险因素有老龄，女性，肥胖，机械应力及软骨下骨量差等，但确切发病机制尚不明确。OA主要累及关节软骨，但其他关节组织如软骨下骨和滑膜等往往也累及，因此近年来有学者认为OA发病是涉及到全关节组织的一种炎症性疾病，自身免疫炎症是OA病程中的重要机制[1]，其中TLR4信号通路介导的自身免疫炎症具有重要研究价值，可能会作为未来改变OA病程的药物治疗靶点[2]。

本研究旨在通过研究国人晚期 OA关节软骨中 TLR4/ NF-B的表达，初步探讨自身免疫反应在国人OA发病机制中的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验组（A组与B组）：2013年9月～2013年11月，因晚期OA行人工全膝关节表面置换术的患者20名，其中女性10名，男性2名，年龄56～78岁，平均68.5岁，所有患者术前x线片显示软骨均明显损伤，按照Kellgren-Lawrence（K-L）分级均为III级和IV级。术中发现软骨损伤情况负重区均符合国际软骨修复协会软骨损伤分级系统（ICRS）的IV度，非负重区为III度。取术中切下的胫骨关节负重区及非负重区软骨，各取2份分别放置于4%多聚甲醛和-70℃冰箱中保存。对照组为在我院确诊为创伤性股骨颈骨折而接受全髋关节置换治疗的患者12名，其中女性8名，男性4名，年龄61～73岁，平均66.3岁，取全髋关节置换手术中患者股骨头负重区软骨为实验对照标本，同样方法保存，大体观察未见软骨损伤。所有病例均排除：类风湿关节炎、SLE等自身免疫疾病，既往髋关节手术史、髋关节炎、髋关节感染、髋关节畸形、代谢性骨病、下肢不等长、髋关节肿瘤史等。

1.2 主要实验仪器

RT-PCR：台式高速冷冻离心机；LifeexpressThermalCycler PCR仪；SLAN荧光定量PCR仪；SW-CJ-1FD超净工作台等。

WesternBlot：752-P紫外分光光度计；TGL-16c台式离心机；neofuge15R冷冻离心机；DYY-6C电泳仪；TL-420D水浴锅；V300扫描仪；alphaEaseFC灰度分析软件。

免疫组化：RM2016切片机；DGX-9003B烘箱；TE2000倒置荧光显微镜。

1.3 主要实验试剂

RT-PCR：Trizol Reagent；三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇；RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit；定量PCR试剂盒。

Western Blot：IPA裂解液、PMSF（100mM）、磷酸化蛋白酶抑制剂、蛋白上样缓冲液、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、ECL、显影定影试剂；BCA蛋白定量检测试剂盒；TRIS、SDS；甘氨酸；PVDF膜0.45um、PVDF膜0.22um；脱脂奶粉；HRP标记山羊抗兔、HRP标记兔抗山羊、HRP标记兔抗小鼠、HRP标记兔抗大鼠。

1.4 实验步骤

1.4.1 RT-PCR检测TLR4、NF-B的mRNA的表达

提取关节软骨组织的总RNA，根据试剂盒说明将总RNA的mRNA逆转录成cDNA。PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳后，将凝胶置于凝胶自动成像仪中，采用Gelswork-D软件分别对实验组负重区、非负重区组和对照组目的基因（TLR4、 NF-B）以及内参照的 -actin的扩增产物进行半定量分析，目的基因mRNA的相对表达量以目的基因光密度值与内参照基因光密度值的比值表示。

1.4.2 蛋白质印迹法（Western Blot）检测TLR4、NF-B蛋白表达

蛋白提取和蛋白浓度测定按照试剂盒说明书进行，Western blot按照常规操作程序进行，转膜后用5%脱脂奶粉封闭2小时，加入用脱脂奶粉稀释的山羊抗TLR4多克隆抗体（1：600稀释），4℃过夜，TBS洗涤后再用二抗常温下孵育，DAB显色，-actin为内参照。底片经扫描仪扫描后分析结果。

1.4.3 免疫组化方法检测TLR4的表达

软骨石蜡包埋组织标本制成切片，常规S-P法染色，用微波修复抗原，滴加TLR4兔抗鼠多克隆一抗（稀释度为1：100）；滴加二抗酶标链霉亲和素复合物，显色，复染，封片。每次检测均以PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。

免疫组化结果用BI-2000图像分析系统测定各切片阳性细胞的积分吸光度值（IA），以细胞质和细胞膜染成棕黄色为阳性细胞，每一个样本随机选取5个高倍视野（×200），计数每平方毫米内阳性细胞数量。

1.5 统计学处理

采用 SPSS19.0统计软件进行统计分析。采用 Kruskal-Wallis秩和检验对实验数据进行统计学分析，＜0.05认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膝关节胫骨负重区软骨、非负重区软骨及正常股骨头负重区软骨中TLR4免疫组化结果

负重区软骨TLR4表达比非负重区软骨TLR4表达明显升高，而对照组正常股骨头软骨组织中TLR4表达较实验组明显减少。如下图所示（彩图见插页）：

图1

图2

图3

图1 A组负重区软骨免疫组化TLR4表达（×200）；图2 B组非负重区软骨免疫组化TLR4表达（×200）；图3 C组正常股骨头软骨免疫组化TLR4表达（×200）

2.2 膝关节胫骨负重区软骨、非负重区软骨及正常股骨头负重区软骨中TLR4及NF-B蛋白表达（免疫组化SP法，×200）

胫骨负重区软骨 TLR4、NF-Bp65蛋白表达的较其他两组明显增高，根据统计学 Kruskal-Wallis秩和检验方法，＜0.05，各组间的差异具有统计学意义（见表1，图4，5）。

表1 实验负重组、非负重组与对照组TLR4、NF-Bp65蛋白表达比较（±s）

表1 实验负重组、非负重组与对照组TLR4、NF-Bp65蛋白表达比较（±s）

注：采用Kruskal-Wallis法，＜0.05；*与对照组比较，＜0.05；**与对照组比较＜0.05；*与**比较＜0.05。

组别OA负重组OA非负重组对照组 12 n NF-Bp65 123.15±0.11* 12 TLR4 2.91±0.09* 1.93±0.07** 0.91±0.05 1.01±0.09 2.11±0.08**

图4 TLR4的Western Blot实验结果

图5 NF-Bp65 Western Blot的实验结果

2.3 Real-timePCR检测实验组和对照组软骨中TLR4及NFB的mRNA表达

A组胫骨负重区软骨TLR4、NF-Bp65的mRNA表达较其他两组明显增高，根据统计学Kruskal-Wallis秩和检验方法，＜0.05，各组间的差异具有统计学意义（见表2，图6，7）。

表2 实验负重组、非负重组与对照组TLR4、NF-Bp65mRNA表达比较（s）

表2 实验负重组、非负重组与对照组TLR4、NF-Bp65mRNA表达比较（s）

注：采用Kruskal-Wallis法，＜0.05；*与对照组比较，＜0.05；**与对照组比较＜0.05；*与**比较＜0.05。

组别OA负重组OA非负重组对照组 12 n TLR4 3.55±0.05* 2.06±0.07** 1.01±0.09 1.00±0.11 NF-Bp65 122.93±0.06* 122.01±0.08**

图6 TLR4 mRNA表达对比柱状图

图7 NF-Bp65 mRNA表达图对 比柱状图

3 讨论

OA发表机制目前尚不明确，近年来认为OA虽然本质是软骨破坏，但其实是一个累及关节所有组织的疾病，自身免疫在其中可能扮演重要角色[1]。Medzhitov等[3]在1997年首次在Nature杂志发文系统阐述了TLR4的分子生物学特性，它属于TLR家族，和其他TLR家族成员一样，TLR4可以特异性识别宿主机体内产生的所谓损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns,DAMPs），启动自身免疫反应，NF-B是TLR4信号通路的重要下游信号分子。在类风湿性关节炎和骨关节炎关节组织破坏时，会产生大量的能被TLR4识别的DAMPs[4,5]，如软骨基质分解产生的透明质酸片段就是TLR4的配体之一[6]，因此有理由相信关节软骨中的TLR4可能会通过与这些配体结合后，启动自身免疫反应从而参与OA发病。

本实验研究了国人OA关节软骨中TLR4和NF-Bp65的表达水平，并与正常关节软骨对照。免疫组化、RT-PCR和WesternBlot的结果数据均显示股骨头负重区、实验组胫骨非负重区及实验组胫骨负重区软骨中TLR4的表达依次增加，推测其原因是OA早期TLR4活化后引发一系列的炎症反应，加重软骨损伤。

国外有研究证实关节软骨中TLR4的表达水平随着关节间隙狭窄的加重而逐渐提高[7,8]，随着 OA患者关节软骨病变的范围扩大，TLR4表达水平也会提高[9]。人和鼠软骨细胞培养时如果TLR4被激活后会引起炎症和软骨细胞的分解反应，包括IL-1，MMP的表达升高，NO释放和PGE2合成增加，聚蛋白聚糖和II型胶原合成下降[9,10]。体外实验显示TLR4的配体-LPS刺激会加剧软骨移植体基质的降解[9]。相反，TLR4-/-小鼠的软骨细胞即使被LPS激活也不会引起相同的分解反应[10]，而且TLR4-/-小鼠对IL-1过表达介导的软骨破坏产生抵抗效应，这和 IL-1介导的内源性 TLR4配体的产生有关[11]。Haglund等[12]用蛋白质组学的方法显示小鼠软骨细胞 TLR4的激活会引起一系列的自身免疫反应，比如补体，长Ptx3，Chi3l1和mimecan的产生，这表明软骨细胞在TLR4激活后可以引起自身免疫反应。

总之，TLR4的激活参与了国人OA的发病机制，具体的分子生物学机制值得进一步研究，这为将来OA的靶向药物治疗提供了新的思路。

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The preliminary research on the expression of toll-like receptor4/NF-B in human knee osteoarthritis

YuYinxian,ChenJinwei,RuanQi,etal.Departmentof Orthopaedics,ShanghaiGeneralHospital Affiliatedto JiaoTong University,Shanghai,200080,China

Objective Explore the expression of TLR4 and NF-B in human knee advanced osteoarthritis cartilage,to clarify the role of autoimmunity in osteoarthritis pathogenesis.Methods The experimental cartilages are obtained from 20 advanced knee osteoarthritis patients（The average age of 68.5years old）following total knee replacement surgery in the weight-bearingareaofthetibialarticularcartilage and thenon-weight-bearingarea.The femoralheadcartilagesof control group are obtained from 12 patients（The average age of 66.3 years old）with traumatic femoral neck fracture received total hip arthroplasty.We use immunohistochemicalmethodstoanalysisthree specimensofTLR4 expression ofcartilage, using RT-PCR and Western Blot to detect the mRNA and protein expression of TLR4 and NF-Bp65 in three groups of cartilage respectively.Results 1.Immunohistochemistry showed that the group of weight-bearing cartilage in knee osteoarthritis has thehighest expressionof TLR4,the group of non-weight-bearingcartilage in knee osteoarthritisexpress second,the groupofnormalfemoral headcartilageexpressleast.2.RT-PCRand Western Blotshow thatthegroup of weightbearingcartilage inknee osteoarthritis havethemost expressionof the mRNA and protein inTLR4andNF-B,thesecond is the group of non-weight-bearing cartilage in knee osteoarthritis,the group of normal femoral head cartilage expresses least.By using of statistical Kruskal-Wallis rank sum test methods,the difference between the groups was statistically significant.Conclusion TLR4 and NF-B express evident in osteoarthritis of the knee cartilage weight-bearing area significantly,indicating that TLR4/NF-B signal pathway overactive in OA and downstream NF-B overexpress may be involved in the pathogenesis of osteoarthritis.

Osteoarthritis;TLR4;NF-B;Cartilage;Autoimmunity

R318

A

10.3969/j.issn.1672-5972.2015.04.002

swgk2015-02-00028

俞银贤（1980-）男，硕士，主治医师。研究方向：关节外科。

*[通讯作者]易诚青（1974-）男，博士，主任医师。研究方向：关节外科。

2015-02-08）

上海交通大学附属第一人民医院骨科，上海200080